El análisis isotópico de posición específica , también llamado análisis isotópico de sitio específico , es una rama del análisis isotópico que tiene como objetivo determinar la composición isotópica de una posición particular de un átomo en una molécula. Los isótopos son variantes elementales con diferentes números de neutrones en sus núcleos, por lo que tienen diferentes masas atómicas. Los isótopos se encuentran en abundancias naturales variables según el elemento; sus abundancias en compuestos específicos pueden variar de distribuciones aleatorias (es decir, distribución estocástica) debido a las condiciones ambientales que actúan sobre las variaciones de masa de manera diferente. Estas diferencias en abundancias se denominan "fraccionamientos", que se caracterizan mediante el análisis de isótopos estables .
Las abundancias de isótopos pueden variar en todo un sustrato (es decir, variación isotópica "en masa"), compuestos específicos dentro de un sustrato (es decir, variación isotópica específica del compuesto) o en posiciones dentro de moléculas específicas (es decir, variación isotópica específica de la posición). Las abundancias de isótopos se pueden medir de diversas formas (por ejemplo, espectrometría de masas de relación i sotope , espectrometría láser, RMN , ESI-MS ). Los primeros análisis variaban en técnica, pero comúnmente estaban limitados por su capacidad de medir solo composiciones isotópicas promedio en moléculas o muestras. Si bien esto permite el análisis isotópico del sustrato en masa, elimina la capacidad de distinguir la variación entre diferentes sitios del mismo elemento dentro de la molécula. El campo de la biogeoquímica isotópica de posición específica estudia estas variaciones intramoleculares, conocidas como enriquecimientos de "isótopos específicos de posición" e "isótopos específicos de sitio". Se centra en los fraccionamientos de isótopos específicos de la posición en muchos contextos, el desarrollo de tecnologías para medir estos fraccionamientos y la aplicación de enriquecimientos de isótopos específicos de la posición a cuestiones relacionadas con la biogeoquímica , la microbiología , la enzimología , la química medicinal y la historia de la Tierra .
Los enriquecimientos de isótopos específicos de la posición pueden retener información crítica sobre la síntesis y la fuente de los átomos en la molécula. De hecho, el análisis de isótopos en masa promedia los efectos de isótopos específicos del sitio en toda la molécula y, por lo tanto, si bien todos esos valores tienen una influencia en el valor en masa, las firmas de procesos específicos pueden diluirse o ser indistinguibles. Si bien la teoría del análisis de isótopos específicos de la posición ha existido durante décadas, [1] ahora existen nuevas tecnologías que permiten que estos métodos sean mucho más comunes. [2] Las aplicaciones potenciales de este enfoque están ampliamente extendidas, como la comprensión del metabolismo en biomoléculas, contaminantes ambientales en el aire, mecanismos de reacción inorgánicos, etc. El análisis de isótopos agrupados , un subconjunto del análisis de isótopos específicos de la posición, ya ha demostrado ser útil para caracterizar fuentes de metano , paleoambiente, paleoaltimetría, entre muchas otras aplicaciones. A continuación, se detallan estudios de casos más específicos de fraccionamiento de isótopos específicos de la posición.
Los isótopos estables no se desintegran y las masas de los isótopos pesados y ligeros afectan la forma en que se distribuyen en el medio ambiente. Cualquier desviación de una distribución aleatoria de los isótopos ligeros y pesados en el medio ambiente se denomina fraccionamiento, y los fraccionamientos constantes como resultado de un proceso o reacción particular se denominan "efectos isotópicos".
Los efectos isotópicos son patrones recurrentes en la distribución de isótopos pesados y ligeros entre diferentes especies o compuestos químicos, o entre sitios atómicos dentro de una molécula. Estos efectos isotópicos pueden surgir de una cantidad casi infinita de procesos, pero la mayoría de ellos se pueden reducir a dos categorías principales, según la naturaleza de la reacción química que crea o destruye el compuesto de interés:
(1) Los efectos isotópicos cinéticos se manifiestan en reacciones irreversibles , cuando se prefiere un isotopólogo en el estado de transición debido al estado de energía más bajo. El isotopólogo preferido dependerá de si el estado de transición de la molécula durante una reacción química es más parecido al del reactivo o al del producto. Los efectos isotópicos normales se definen como aquellos que dividen el isótopo más ligero en los productos de la reacción. Los efectos isotópicos inversos son menos comunes, ya que dividen preferentemente el isótopo más pesado en los productos.
(2) Los efectos isotópicos de equilibrio se manifiestan en reacciones reversibles , cuando las moléculas pueden intercambiarse libremente para alcanzar el estado de energía más bajo posible.
Estas variaciones pueden ocurrir a nivel de compuestos específicos, pero también a nivel de posiciones específicas dentro de una molécula. Por ejemplo, el sitio carboxilo de los aminoácidos es intercambiable y, por lo tanto, su firma isotópica de carbono puede cambiar con el tiempo y puede no representar la fuente de carbono original de la molécula.
Las reacciones químicas en los procesos biológicos están controladas por enzimas que catalizan la conversión de sustrato en producto. Dado que las enzimas pueden alterar la estructura del estado de transición de las reacciones, también cambian los efectos isotópicos cinéticos y de equilibrio. Colocada en el contexto de un metabolismo , la expresión de los efectos isotópicos en las biomoléculas está controlada además por los puntos de ramificación. Diferentes vías de biosíntesis utilizarán diferentes enzimas, produciendo un rango de enriquecimientos isotópicos específicos de la posición. Esta variabilidad permite mediciones isotópicas específicas de la posición para discernir múltiples vías biosintéticas a partir del mismo producto metabólico. [3] Los biogeoquímicos utilizan enriquecimientos isotópicos específicos de la posición de aminoácidos , lípidos y azúcares en la naturaleza para interpretar la importancia relativa de diferentes metabolismos.
El efecto isotópico específico de la posición de una reacción enzimática se expresa como la relación de las constantes de velocidad para un sustrato monoisotópico y un sustrato sustituido con un isótopo raro. Por ejemplo, la enzima formiato deshidrogenasa cataliza la reacción de formiato y NAD + a dióxido de carbono y NADH. El hidrógeno del formiato se transfiere directamente a NAD+. Este paso tiene un efecto isotópico, porque la velocidad de transferencia de protio del formiato a NAD+ es casi tres veces más rápida que la velocidad de la misma reacción con una transferencia de deuterio . Este es también un ejemplo de un efecto isotópico primario. [4] Un efecto isotópico primario es aquel en el que el isótopo raro se sustituye donde se rompe o se forma un enlace. Los efectos isotópicos secundarios ocurren en otras posiciones en la molécula y están controlados por la geometría molecular del estado de transición. Estos generalmente se consideran insignificantes pero surgen en ciertos casos, especialmente para los isótopos de hidrógeno . [4]
A diferencia de las reacciones abióticas, las reacciones enzimáticas se producen a través de una serie de pasos, que incluyen la unión del sustrato con la enzima, la conversión del sustrato en producto y la disociación del complejo enzima-producto. El efecto isotópico observado de una enzima estará controlado por el paso limitante de velocidad en este mecanismo. Si el paso que convierte el sustrato en producto es limitante de velocidad, la enzima expresará su efecto isotópico intrínseco, el de la reacción de formación o ruptura de enlaces. [5]
Al igual que las moléculas bióticas, el enriquecimiento de isótopos específicos en las moléculas abióticas puede reflejar la fuente de los precursores químicos y las vías de síntesis. La energía para las reacciones abióticas puede provenir de muchas fuentes diferentes, lo que afectará el fraccionamiento. Por ejemplo, los catalizadores metálicos pueden acelerar las reacciones abióticas. Las reacciones pueden ralentizarse o acelerarse en diferentes condiciones de temperatura y presión, lo que afectará la constante de equilibrio o la energía de activación de las reacciones reversibles e irreversibles, respectivamente.
Por ejemplo, el carbono en el medio interestelar y la nebulosa solar se divide en estados distintos en función de su favorabilidad termodinámica. La medición de los enriquecimientos isotópicos específicos del sitio de carbono a partir de moléculas orgánicas extraídas de condritas carbonosas puede dilucidar de dónde proviene cada átomo de carbono y cómo las moléculas orgánicas pueden sintetizarse abióticamente. [6] En términos más generales, estos enriquecimientos isotópicos pueden proporcionar información sobre los procesos físicos en la región donde se formaron los precursores moleculares y dónde se formó la molécula en el sistema solar (es decir, heterogeneidad nucleosintética, fraccionamiento independiente de la masa , autoprotección, etc.).
Otro ejemplo de fraccionamientos específicos del sitio en moléculas abióticas es la síntesis de tipo Fischer-Tropsch , que se cree que produce cadenas de hidrocarburos abiogénicos. [6] A través de este mecanismo de reacción, los enriquecimientos de carbono del sitio se agotarían a medida que aumenta la longitud de la cadena de carbono y serían distintos de los enriquecimientos específicos del sitio de hidrocarburos de origen biológico.
Los sustratos deben prepararse y analizarse de una manera específica para dilucidar los enriquecimientos de isótopos específicos del sitio. Esto requiere una separación limpia del compuesto de interés de la muestra original, lo que puede requerir una variedad de químicas preparatorias diferentes. Una vez aislados, los enriquecimientos de isótopos específicos de la posición se pueden analizar con una variedad de instrumentos, todos los cuales tienen diferentes ventajas y brindan distintos grados de precisión .
Para medir los efectos cinéticos de los isótopos en las reacciones enzimáticas, los bioquímicos realizan experimentos in vitro con enzimas y sustratos. El objetivo de estos experimentos es medir la diferencia en las velocidades de reacción enzimática para el sustrato monoisotópico y el sustrato con un isótopo raro. [5] Hay dos técnicas de uso popular en estos experimentos: estudios de competencia interna y experimentos de comparación directa. Ambos miden los efectos de los isótopos específicos de la posición.
Los experimentos de comparación directa se utilizan principalmente para medir los efectos de los isótopos de hidrógeno y deuterio en reacciones enzimáticas. El sustrato monoisotópico y una forma deuterada del sustrato se exponen por separado a la enzima de interés en un rango de concentraciones. Se determinan los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten para ambos sustratos y el efecto isotópico específico de la posición en el sitio de deuteración se expresa como la relación entre la constante de velocidad monoisotópica y la constante de velocidad del isótopo raro. [7]
Para los isótopos de elementos como el carbono y el azufre , la diferencia en los parámetros cinéticos es demasiado pequeña y la precisión de la medición demasiado baja para medir un efecto isotópico comparando directamente las tasas de los sustratos monoisotópicos y de isótopos raros. En cambio, los dos se mezclan utilizando la abundancia natural de isótopos estables en las moléculas. La enzima se expone a ambos isótopos simultáneamente y su preferencia por el isótopo ligero se analiza recolectando el producto de la reacción y midiendo su composición isotópica. Por ejemplo, si una enzima elimina un carbono de una molécula convirtiéndolo en dióxido de carbono , ese producto de dióxido de carbono se puede recolectar y medir en un espectrómetro de masas de relación isotópica para determinar su composición isotópica de carbono . Si el dióxido de carbono tiene menos 13 C que la mezcla de sustrato, la enzima ha reaccionado preferentemente con el sustrato que tiene 12 C en el sitio que se descarboxila . De esta manera, los experimentos de competencia interna también son específicos de la posición. Si solo se mide el CO 2 , entonces solo se registra el efecto isotópico en el sitio de descarboxilación. [5]
Antes de la llegada de tecnologías que analizan moléculas enteras para determinar su estructura isotópica intramolecular, las moléculas se degradaban secuencialmente y se convertían en CO2 y se medían en un espectrómetro de masas de relación isotópica , revelando enriquecimientos de 13 C en posiciones específicas .
En 1961, Abelson y Hoering desarrollaron una técnica para eliminar el ácido carboxílico de los aminoácidos mediante la reacción de la ninhidrina . Esta reacción convierte el ácido carboxílico en una molécula de CO2 que se mide mediante un espectrómetro de masas de relación isotópica. [1]
Los lípidos son de particular interés para los geoquímicos de isótopos estables porque se conservan en las rocas durante millones de años. Monson y Hayes utilizaron la ozonólisis para caracterizar las abundancias de isótopos específicos de la posición de los ácidos grasos insaturados , convirtiendo diferentes posiciones de carbono en dióxido de carbono. Utilizando esta técnica, midieron directamente un patrón isotópico en los ácidos grasos que se había predicho durante años. [8]
En algunos casos, será necesario agregar grupos funcionales adicionales a las moléculas para facilitar otros métodos de separación y análisis. La derivatización puede cambiar las propiedades de un analito; por ejemplo, haría que un compuesto polar y no volátil se volviera no polar y más volátil, lo que sería necesario para el análisis en ciertos tipos de cromatografía . Sin embargo, es importante señalar que la derivatización no es ideal para los análisis específicos del sitio, ya que agrega elementos adicionales que deben tenerse en cuenta en los análisis.
La cromatografía facilita la separación de moléculas distintas dentro de una mezcla en función de sus respectivas propiedades químicas y de cómo interactúan esas propiedades con el sustrato que recubre la columna cromatográfica. Esta separación puede ocurrir "en línea", durante la medición misma o antes de las mediciones para aislar un compuesto puro. La cromatografía de gases y la cromatografía de líquidos tienen ventajas diferenciadas, en función de las moléculas de interés. Por ejemplo, las moléculas solubles en agua se separan más fácilmente con la cromatografía de líquidos, mientras que las moléculas volátiles y no polares, como el propano o el etano, se separan con la cromatografía de gases.
Se puede utilizar una variedad de instrumentos diferentes para realizar análisis de isótopos específicos de la posición, y cada uno tiene ventajas y desventajas diferentes. Muchos de ellos requieren la comparación de la muestra de interés con un estándar de composición isotópica conocida; el fraccionamiento dentro del instrumento y la variación de las condiciones instrumentales a lo largo del tiempo pueden afectar la precisión de las mediciones individuales si no están estandarizadas.
Las mediciones iniciales de enriquecimientos de isótopos específicos de posición se midieron utilizando espectrometría de masas de relación isotópica en la que los sitios en una molécula primero se degradaron a CO 2 , el CO 2 se capturó y purificó, y luego el CO 2 se midió para su composición isotópica en un espectrómetro de masas de relación isotópica (IRMS). Py-GC-MS también se utilizó en estos experimentos para degradar aún más las moléculas y caracterizar sus distribuciones isotópicas intramoleculares. [1] Tanto GC-MS como LC-MS son capaces de caracterizar enriquecimientos de isótopos específicos de posición en moléculas marcadas isotópicamente . En estas moléculas, 13 C es tan abundante que puede verse en un espectrómetro de masas con baja sensibilidad. La resolución de estos instrumentos puede distinguir dos moléculas con una diferencia de 1 Dalton en sus masas moleculares; sin embargo, esta diferencia podría surgir de la adición de muchos isótopos raros ( 17 O, 13 C, 2 H, etc.). Por esta razón, los espectrómetros de masas que utilizan cuadrupolos o técnicas de detección de tiempo de vuelo no se pueden utilizar para medir enriquecimientos específicos de la posición en abundancias naturales .
La espectroscopia láser se puede utilizar para medir los enriquecimientos isotópicos de los gases en el medio ambiente. La espectroscopia láser aprovecha las diferentes frecuencias vibratorias de los isotopólogos que hacen que absorban diferentes longitudes de onda de luz. La transmisión de luz a través de la muestra gaseosa a una temperatura controlada se puede convertir cuantitativamente en una declaración sobre la composición isotópica. Para N2O, estas mediciones pueden determinar los enriquecimientos isotópicos específicos de la posición de ( 15 N. [9] Estas mediciones son rápidas y pueden alcanzar una precisión relativamente buena (1-10 por mil ). Se utiliza para caracterizar los flujos de gases ambientales y los efectos sobre estos flujos . [10] Este método se limita a la medición y caracterización de gases.
La resonancia magnética nuclear observa pequeñas diferencias en las reacciones moleculares a los campos magnéticos oscilantes . Es capaz de caracterizar átomos con nucleidos activos que tienen un espín nuclear distinto de cero (p. ej., 13 C, 1 H, 17 O 35 Cl, 15 N, 37 Cl), lo que la hace particularmente útil para identificar ciertos isótopos. En la RMN típica de protón o 13C, se miden los desplazamientos químicos de los átomos de protio (1H) y carbono-13 dentro de una molécula, respectivamente, a medida que son excitados por un campo magnético y luego se relajan con una frecuencia de resonancia diagnóstica. Con la RMN de fraccionamiento de isótopos naturales específicos del sitio ( SNIF ), se miden las resonancias de relajación de los átomos de deuterio y 13C. [11] La RMN no tiene la sensibilidad para detectar isotópogos con múltiples isótopos raros. Los únicos picos que aparecen en un espectro de RMN SNIF son los de los isotópogos con un solo isótopo raro. Dado que el instrumento solo mide las resonancias de los isótopos raros, cada isotopólogo tendrá un pico. Por ejemplo, una molécula con seis átomos de carbono químicamente únicos tendrá seis picos en un espectro de RMN SNIF de 13C. El sitio de sustitución de 13C se puede determinar mediante el desplazamiento químico de cada uno de los picos. Como resultado, la RMN puede identificar enriquecimientos de isótopos específicos del sitio dentro de las moléculas. [11] [12]
El Orbitrap es un espectrómetro de masas de transformada de Fourier de alta resolución que ha sido adaptado recientemente para permitir análisis específicos del sitio. [2] Las moléculas introducidas en el Orbitrap se fragmentan , aceleran y analizan. Debido a que el Orbitrap caracteriza las masas moleculares midiendo las oscilaciones en frecuencias de radio , puede alcanzar niveles muy altos de precisión, dependiendo del método de medición (es decir, hasta 0,1 por mil para tiempos de integración largos). Es significativamente más rápido que las mediciones de isótopos específicos del sitio que se pueden realizar usando RMN , y puede medir moléculas con diferentes isótopos raros pero la misma masa nominal en abundancias naturales (a diferencia de GC y LCMS). También es ampliamente generalizable a moléculas que se pueden introducir a través de un disolvente gaseoso o líquido. [2] La resolución del Orbitrap es tal que las isobaras nominales (por ejemplo, enriquecimientos de 2 H versus 15 N versus 13 C ) se pueden distinguir entre sí, por lo que las moléculas no necesitan convertirse en un sustrato homogéneo para facilitar el análisis de isótopos. Al igual que otras mediciones de isótopos, las mediciones de enriquecimientos específicos del sitio en el Orbitrap deben compararse con un estándar de composición conocida. [2]
Para ilustrar la utilidad de los enriquecimientos de isótopos en función de la posición, a continuación se describen varios estudios de casos en los que los científicos utilizaron análisis de isótopos en función de la posición para responder preguntas importantes sobre la bioquímica, la contaminación y el clima.
La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) es una enzima que combina bicarbonato y fosfoenolpiruvato (PEP) para formar el ácido de cuatro carbonos, oxaloacetato . Es una enzima importante en la fotosíntesis C4 y las vías anapleróticas . [13] También es responsable del enriquecimiento específico de la posición del oxaloacetato, debido al efecto isotópico de equilibrio de convertir la molécula lineal CO 2 en la molécula trigonal plana HCO 3 -, que divide 13 C en bicarbonato. [14] Dentro de la enzima PEPC, H 12 CO 3 - reacciona 1,0022 veces más rápido que H 13 CO 3 -, por lo que PEPC tiene un efecto isotópico cinético del 0,22%. [15] Esto no es suficiente para compensar el enriquecimiento de 13 C en bicarbonato. Por lo tanto, el oxaloacetato queda con un carbono enriquecido con 13 C en la posición C4. Sin embargo, el sitio C1 experimenta un pequeño efecto isotópico secundario inverso debido a su entorno de enlace en el estado de transición , dejando el sitio C1 del oxaloacetato enriquecido en 13 C. [16] De esta manera, el PEPC divide simultáneamente 12 C en el sitio C4 y 13 C en el sitio C1 del oxaloacetato, un ejemplo de múltiples efectos isotópicos específicos de la posición.
El primer artículo sobre enriquecimiento específico del sitio utilizó la reacción de ninhidrina para escindir el sitio carboxilo de los alfa-aminoácidos en organismos fotosintéticos . [1] Los autores demostraron un sitio carboxilo enriquecido en relación con el δ 13 C en masa de las moléculas, lo que atribuyen a la absorción de CO 2 más pesado a través del ciclo de Calvin . [1] Un estudio reciente aplicó una teoría similar para comprender los enriquecimientos en metionina, que sugirieron que sería poderosa en los estudios de origen y síntesis. [17]
En 2012, un equipo de científicos utilizó la espectroscopia de RMN para medir todas las abundancias de isótopos de carbono de posición específica de la glucosa y otros azúcares. Se demostró que las abundancias de isótopos son heterogéneas . Diferentes porciones de las moléculas de azúcar se utilizan para la biosíntesis en función de la vía metabólica que utiliza un organismo. [12] Por lo tanto, cualquier interpretación de los isótopos de posición específica de las moléculas aguas abajo de la glucosa tiene que considerar esta heterogeneidad intramolecular.
La glucosa es el monómero de la celulosa, el polímero que da rigidez a las plantas y los árboles. Después de la aparición de los análisis de glucosa en función de la posición, unos biogeoquímicos de Suecia analizaron los anillos concéntricos de un árbol de Pinus nigra que registró un crecimiento anual entre 1961 y 1995. Digirieron la celulosa hasta sus unidades de glucosa y utilizaron la espectroscopia de RMN para analizar sus patrones isotópicos intramoleculares. Encontraron correlaciones con enriquecimientos de isótopos en función de la posición que no eran evidentes con el análisis de isótopos de carbono de la molécula completa de glucosa. Al medir los enriquecimientos en función de la posición en la molécula de glucosa de 6 carbonos, recopilaron seis veces más información de la misma muestra. [18]
La biosíntesis de los ácidos grasos comienza con los precursores de acetil-CoA que se unen para formar lípidos de cadena larga y lineal . El acetil-CoA es producido en organismos aeróbicos por la piruvato deshidrogenasa , una enzima que ha demostrado expresar un gran efecto isotópico del 2,3% en el sitio C2 del piruvato y un pequeño fraccionamiento en el sitio C3. [19] Estos se convierten en las posiciones de carbono impares y pares de los ácidos grasos respectivamente y, en teoría, darían como resultado un patrón de depleciones y enriquecimientos de 13 C en posiciones impares y pares, respectivamente. En 1982, Monson y Hayes desarrollaron una tecnología para medir las abundancias de isótopos de carbono específicos de la posición de los ácidos grasos. Sus experimentos en Escherichia coli revelaron los enriquecimientos relativos de 13 C previstos en los sitios de carbono impares. [20] Sin embargo, este patrón no se encontró en Saccharomyces cerevisiae que fueron alimentados con glucosa. En cambio, sus ácidos grasos se enriquecieron con 13 C en las posiciones impares. [8] Esto se ha interpretado como un producto de los efectos isotópicos durante la degradación de los ácidos grasos o la heterogeneidad isotópica intramolecular de la glucosa que en última instancia se refleja en los patrones de posición específica de los ácidos grasos. [21]
El enriquecimiento isotópico específico del sitio de N 2 O se mide en el medio ambiente para ayudar a desentrañar las fuentes y sumideros microbianos en el medio ambiente. Diferentes isotopólogos de N2O absorben luz en diferentes longitudes de onda. La espectroscopia láser convierte estas diferencias a medida que escanea a través de las longitudes de onda para medir la abundancia de 14 N- 15 N- 16 O frente a 15 N- 14 N- 16 O, una distinción que es imposible en otros instrumentos. Estas mediciones han logrado una precisión muy alta, de hasta 0,2 por mil. [10]
Los isótopos con una posición específica se pueden utilizar para rastrear contaminantes ambientales a través del entorno local y global. [22] Esto es especialmente útil ya que los isótopos pesados se utilizan a menudo para sintetizar sustancias químicas y luego se incorporan al entorno natural a través de la biodegradación . Por lo tanto, el rastreo de isótopos con una posición específica en el medio ambiente puede ayudar a rastrear el movimiento de estos contaminantes y productos químicos.
Estos estudios de casos representan algunas aplicaciones potenciales para el análisis de isótopos de posición específica, pero ciertamente no todas. Las oportunidades de medir muestras y caracterizar procesos son prácticamente ilimitadas, y los nuevos desarrollos metodológicos ayudarán a hacer posibles estas mediciones en el futuro.
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