La fosfoenolpiruvato carboxilasa (también conocida como PEP carboxilasa , PEPCase o PEPC ; EC 4.1.1.31, PDB ID: 3ZGE) es una enzima de la familia de las carboxi-liasas que se encuentran en plantas y algunas bacterias y que cataliza la adición de bicarbonato (HCO 3 - ) a fosfoenolpiruvato (PEP) para formar el compuesto de cuatro carbonos oxalacetato y fosfato inorgánico : [1]
Esta reacción se utiliza para la fijación de carbono en CAM (metabolismo del ácido crasuláceo) y organismos C 4 , así como para regular el flujo a través del ciclo del ácido cítrico (también conocido como ciclo de Krebs o TCA ) en bacterias y plantas. La estructura de la enzima y su mecanismo catalítico irreversible de dos pasos han sido bien estudiados. La PEP carboxilasa está altamente regulada, tanto por fosforilación como por alosterio .
La enzima PEP carboxilasa está presente en plantas y algunos tipos de bacterias, pero no en hongos ni animales (incluidos los humanos). [2] Los genes varían entre organismos, pero se conservan estrictamente alrededor de los sitios activos y alostéricos discutidos en las secciones de mecanismo y regulación. También se conserva la estructura terciaria de la enzima. [3]
Se ha determinado la estructura cristalina de la PEP carboxilasa en múltiples organismos, incluidos Zea mays (maíz) y Escherichia coli . [3] La enzima general existe como un dímero de dímeros: dos subunidades idénticas interactúan estrechamente para formar un dímero a través de puentes salinos entre la arginina (R438; las posiciones exactas pueden variar según el origen del gen) y el ácido glutámico (E433). residuos. [4] Este dímero se ensambla (más libremente) con otro de su tipo para formar el complejo de cuatro subunidades. Las subunidades de monómero están compuestas principalmente de hélices alfa (65%), [1] y tienen una masa de 106 kDa cada una. [5] La longitud de la secuencia es de aproximadamente 966 aminoácidos . [6]
El sitio activo de la enzima no está completamente caracterizado. Incluye un residuo de ácido aspártico conservado (D564) y ácido glutámico (E566) que se unen de forma no covalente a un ion cofactor de metal divalente a través de los grupos funcionales de ácido carboxílico . [1] Este ion metálico puede ser magnesio , manganeso o cobalto dependiendo del organismo, [1] [2] y su función es coordinar la molécula de fosfoenolpiruvato, así como los intermediarios de la reacción. Se cree que un residuo de histidina (H138) en el sitio activo facilita la transferencia de protones durante el mecanismo catalítico. [1] [4]
El mecanismo de la PEP carboxilasa ha sido bien estudiado. El mecanismo enzimático de formación de oxalacetato es muy exotérmico y, por tanto, irreversible; el cambio biológico de energía libre de Gibbs (△G°') es -30kJmol −1 . [1] Los sustratos y el cofactor se unen en el siguiente orden: cofactor metálico (ya sea Co 2+ , Mg 2+ o Mn 2+ ), PEP, bicarbonato (HCO 3 − ). [1] [2] El mecanismo se desarrolla en dos pasos principales, como se describe a continuación y se muestra en la figura 2:
El cofactor metálico es necesario para coordinar los intermedios enolato y dióxido de carbono; la molécula de CO 2 sólo se pierde el 3% de las veces. [2] El sitio activo es hidrófobo para excluir el agua , ya que el intermedio de carboxifosfato es susceptible a la hidrólisis . [1]
Las tres funciones más importantes que desempeña la PEP carboxilasa en el metabolismo de plantas y bacterias son el ciclo C 4 , el ciclo CAM y el flujo de biosíntesis del ciclo del ácido cítrico .
El principal mecanismo de asimilación del dióxido de carbono en las plantas es a través de la enzima ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (también conocida como RuBisCO ), que añade CO 2 a la ribulosa-1,5-bisfosfato (un azúcar de 5 carbonos), para Forman dos moléculas de 3-fosfoglicerato (azúcares de 2x3 carbonos). Sin embargo, a temperaturas más altas y concentraciones de CO 2 más bajas , RuBisCO agrega oxígeno en lugar de dióxido de carbono, para formar el producto inutilizable glicolato en un proceso llamado fotorrespiración . Para evitar este proceso derrochador, las plantas aumentan la concentración local de CO 2 en un proceso llamado ciclo de C 4 . [3] [8] La PEP carboxilasa desempeña el papel clave de unir CO 2 en forma de bicarbonato con PEP para crear oxaloacetato en el tejido del mesófilo . Luego, este se convierte nuevamente en piruvato (a través de un intermediario malato ), para liberar el CO 2 en la capa más profunda de las células de la vaina del haz para la fijación de carbono mediante RuBisCO y el ciclo de Calvin . El piruvato se convierte nuevamente en PEP en las células del mesófilo y el ciclo comienza de nuevo, bombeando así activamente CO 2 . [2] [9] [10]
La segunda importancia biológica importante y muy similar de la PEP carboxilasa está en el ciclo CAM . Este ciclo es común en organismos que viven en hábitats áridos. Las plantas no pueden permitirse el lujo de abrir los estomas durante el día para absorber CO2 , ya que perderían demasiada agua por transpiración . En cambio, los estomas se abren por la noche, cuando la evaporación del agua es mínima, y absorben CO 2 fijándolos con PEP para formar oxaloacetato a través de la PEP carboxilasa. El oxalacetato se convierte en malato mediante la malato deshidrogenasa y se almacena para su uso durante el día cuando la reacción dependiente de la luz genera energía (principalmente en forma de ATP ) y equivalentes reductores como NADPH para ejecutar el ciclo de Calvin . [2] [3] [10]
En tercer lugar, la PEP carboxilasa es importante en las vías metabólicas no fotosintéticas. La Figura 3 muestra este flujo metabólico (y su regulación). Similar a la piruvato carboxilasa , la PEP carboxilasa repone el oxaloacetato en el ciclo del ácido cítrico. Al final de la glucólisis , la PEP se convierte en piruvato , que a su vez se convierte en acetil-coenzima-A ( acetil-CoA ), que entra en el ciclo del ácido cítrico al reaccionar con oxaloacetato para formar citrato . Para aumentar el flujo a lo largo del ciclo, parte de la PEP se convierte en oxaloacetato mediante la PEP carboxilasa. Dado que los intermediarios del ciclo del ácido cítrico proporcionan un centro para el metabolismo, aumentar el flujo es importante para la biosíntesis de muchas moléculas, como por ejemplo los aminoácidos . [11]
La PEP carboxilasa está sujeta principalmente a dos niveles de regulación: fosforilación y alosteria . La Figura 3 muestra un esquema del mecanismo regulatorio.
La fosforilación por la fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa activa la enzima, mientras que la fosfoenolpiruvato carboxilasa fosfatasa la desactiva. Tanto la quinasa como la fosfatasa están reguladas por la transcripción . Además, se cree que el malato actúa como un inhibidor de la retroalimentación de los niveles de expresión de la quinasa y como un activador de la expresión de la fosfatasa (transcripción). [12] Dado que el oxaloacetato se convierte en malato en los organismos CAM y C 4 , las altas concentraciones de malato activan la expresión de la fosfatasa; la fosfatasa posteriormente se desfosforila y, por lo tanto, desactiva la PEP carboxilasa, lo que no conduce a una mayor acumulación de oxaloacetato y, por lo tanto, a una mayor conversión. de oxaloacetato a malato. Por tanto, la producción de malato está regulada a la baja. [1] [12]
Los principales inhibidores alostéricos de la PEP carboxilasa son los ácidos carboxílicos malato (débil) y aspartato (fuerte). [5] [12] Dado que el malato se forma en el siguiente paso de los ciclos CAM y C 4 después de que la PEP carboxilasa cataliza la condensación de CO 2 y PEP en oxaloacetato, esto funciona como una vía de inhibición por retroalimentación. El oxalacetato y el aspartato son fácilmente interconvertibles mediante un mecanismo de transaminasas ; por tanto, las altas concentraciones de aspartato también son una vía de inhibición por retroalimentación de la PEP carboxilasa.
Los principales activadores alostéricos de la PEP carboxilasa son el acetil-CoA [13] y la fructosa-1,6-bisfosfato (F-1,6-BP). [1] [13] Ambas moléculas son indicadores de niveles elevados de glucólisis y, por lo tanto, efectores positivos de retroalimentación de la PEP carboxilasa. Señalan la necesidad de producir oxaloacetato para permitir un mayor flujo a través del ciclo del ácido cítrico . Además, una mayor glucólisis significa que hay un mayor suministro de PEP disponible y, por lo tanto, más capacidad de almacenamiento para unir CO 2 en el transporte al ciclo de Calvin . También es digno de mención que el efector negativo aspartato compite con el efector positivo acetil-CoA , lo que sugiere que comparten un sitio de unión alostérico. [14]
Los estudios han demostrado que los equivalentes de energía como AMP , ADP y ATP no tienen ningún efecto significativo sobre la PEP carboxilasa. [15]
Las magnitudes de los efectos alostéricos de estas diferentes moléculas sobre la actividad de la PEP carboxilasa dependen de cada organismo individual. [dieciséis]
