Las sintasas de óxido nítrico ( EC 1.14.13.39) ( NOS ) son una familia de enzimas que catalizan la producción de óxido nítrico (NO) a partir de L-arginina . El NO es una importante molécula de señalización celular . Ayuda a modular el tono vascular , la secreción de insulina , el tono de las vías respiratorias y el peristaltismo , y está involucrado en la angiogénesis y el desarrollo neuronal. Puede funcionar como un neurotransmisor retrógrado . El óxido nítrico está mediado en mamíferos por las isoenzimas controladas por calcio - calmodulina eNOS ( NOS endotelial ) y nNOS (NOS neuronal). [2] La isoforma inducible, iNOS, involucrada en la respuesta inmune, se une a la calmodulina en concentraciones fisiológicamente relevantes y produce NO como un mecanismo de defensa inmune, ya que el NO es un radical libre con un electrón desapareado. Es la causa próxima del choque séptico y puede funcionar en la enfermedad autoinmune .
La NOS cataliza la reacción: [3]
Las isoformas de NOS catalizan otras reacciones secundarias y de fuga, como la producción de superóxido a expensas del NADPH. Por lo tanto, esta estequiometría no se observa en general y refleja los tres electrones que aporta el NADPH por NO.
Las isoenzimas eucariotas de NOS son catalíticamente autosuficientes. El flujo de electrones es: NADPH → FAD → FMN → hemo → O 2 . La tetrahidrobiopterina proporciona un electrón adicional durante el ciclo catalítico que se reemplaza durante el recambio. El zinc , aunque no es un cofactor, también participa, pero como elemento estructural. [4] Las NOS son únicas en el sentido de que utilizan cinco cofactores y son la única enzima conocida que se une al dinucleótido de flavina y adenina (FAD), al mononucleótido de flavina (FMN), al hemo , a la tetrahidrobiopterina (BH 4 ) y a la calmodulina . [ cita requerida ]
La síntesis de NO derivada de arginina se ha identificado en mamíferos, peces, aves, invertebrados y bacterias. [5] Los mejor estudiados son los mamíferos, donde tres genes distintos codifican isoenzimas NOS : neuronal (nNOS o NOS-1), inducible por citocinas (iNOS o NOS-2) y endotelial (eNOS o NOS-3). [3] iNOS y nNOS son solubles y se encuentran predominantemente en el citosol , mientras que eNOS está asociada a la membrana. Se ha encontrado evidencia de señalización de NO en plantas, pero los genomas de las plantas carecen de homólogos de la superfamilia que genera NO en otros reinos.
En los mamíferos, la isoforma endotelial es el generador de señales principal en el control del tono vascular, la secreción de insulina y el tono de las vías respiratorias , y está involucrada en la regulación de la función cardíaca y la angiogénesis (crecimiento de nuevos vasos sanguíneos). Se ha demostrado que el NO producido por eNOS es un vasodilatador idéntico al factor relajante derivado del endotelio producido en respuesta al esfuerzo cortante del aumento del flujo sanguíneo en las arterias. Esto dilata los vasos sanguíneos al relajar el músculo liso en sus revestimientos. eNOS es el controlador principal del tono del músculo liso. El NO activa la guanilato ciclasa , que induce la relajación del músculo liso al:
La eNOS desempeña un papel fundamental en el desarrollo del corazón embrionario y en la morfogénesis de las arterias coronarias y las válvulas cardíacas. [6]
La isoforma neuronal está involucrada en el desarrollo del sistema nervioso. Funciona como un neurotransmisor retrógrado importante en la potenciación a largo plazo y, por lo tanto, es probable que sea importante en la memoria y el aprendizaje. La nNOS tiene muchas otras funciones fisiológicas, incluida la regulación de la función cardíaca y el peristaltismo y la excitación sexual en hombres y mujeres. Una forma de nNOS con empalme alternativo es una proteína muscular importante que produce señales en respuesta a la liberación de calcio del SR. La nNOS en el corazón protege contra la arritmia cardíaca inducida por el infarto de miocardio. [7]
El receptor principal del NO producido por eNOS y nNOS es la guanilato ciclasa soluble, pero se han identificado muchos objetivos secundarios. La S-nitrosilación parece ser un modo de acción importante.
La isoforma inducible iNOS produce grandes cantidades de NO como mecanismo de defensa. Es sintetizada por muchos tipos de células en respuesta a las citocinas y es un factor importante en la respuesta del organismo al ataque de parásitos, infecciones bacterianas y crecimiento tumoral. También es la causa del choque séptico y puede desempeñar un papel en muchas enfermedades de etiología autoinmune.
La señalización de NOS está implicada en el desarrollo y la fertilización de los vertebrados. Se la ha relacionado con las transiciones entre los estados vegetativo y reproductivo en los invertebrados y con la diferenciación que conduce a la formación de esporas en los mohos mucilaginosos. El NO producido por la NOS bacteriana protege contra el daño oxidativo.
La actividad de NOS también se ha correlacionado con episodios depresivos mayores (EDM) en el contexto del trastorno depresivo mayor , en un gran estudio de tratamiento de casos y controles publicado a mediados de 2021. Se compararon 460 pacientes con un episodio depresivo mayor actual con 895 pacientes sanos y, al medir la relación L-citrulina/L-arginina antes y después de 3 a 6 meses de tratamiento con antidepresivos, los resultados indican que los pacientes en un episodio depresivo mayor tienen una actividad de NOS significativamente menor en comparación con los pacientes sanos, mientras que el tratamiento con antidepresivos elevó significativamente los niveles de actividad de NOS en pacientes en un episodio depresivo mayor. [8]
Los diferentes miembros de la familia NOS están codificados por genes separados. [9] Hay tres isoformas conocidas en mamíferos, dos son constitutivas (cNOS) y la tercera es inducible (iNOS). [10] La clonación de enzimas NOS indica que cNOS incluye tanto el gen constitutivo cerebral ( NOS1 ) como el constitutivo endotelial ( NOS3 ); el tercero es el gen inducible ( NOS2 ). [10] Recientemente, se ha demostrado la actividad de NOS en varias especies bacterianas, incluidos los notorios patógenos Bacillus anthracis y Staphylococcus aureus. [11]
Las diferentes formas de la NO sintasa se han clasificado de la siguiente manera:
La NOS neuronal (nNOS) produce NO en el tejido nervioso tanto en el sistema nervioso central como en el periférico . Sus funciones incluyen: [12]
La NOS neuronal también desempeña un papel en la comunicación celular y está asociada con las membranas plasmáticas. La acción de la NOS puede ser inhibida por NPA ( N-propil-L-arginina ). Esta forma de la enzima es inhibida específicamente por el 7-nitroindazol . [13]
La localización subcelular de nNOS en el músculo esquelético está mediada por el anclaje de nNOS a la distrofina . nNOS contiene un dominio N-terminal adicional, el dominio PDZ . [14]
El gen que codifica la nNOS se encuentra en el cromosoma 12. [15]
A diferencia de la regulación crítica dependiente del calcio de las enzimas NOS constitutivas (nNOS y eNOS), la iNOS se ha descrito como insensible al calcio, probablemente debido a su estrecha interacción no covalente con la calmodulina (CaM) y el Ca 2+ . El gen que codifica la iNOS se encuentra en el cromosoma 17. [15] Aunque la evidencia de la expresión "basal" de la iNOS ha sido esquiva, la activación dependiente de IRF1 y NF-κB del promotor inducible de la NOS respalda una estimulación mediada por la inflamación de esta transcripción. La iNOS produce grandes cantidades de NO tras la estimulación, como por ejemplo mediante citocinas proinflamatorias (p. ej., interleucina-1 , factor de necrosis tumoral alfa e interferón gamma ). [16]
La inducción de la producción elevada de iNOS suele producirse en un entorno oxidativo, por lo que los niveles elevados de NO tienen la oportunidad de reaccionar con el superóxido, lo que conduce a la formación de peroxinitrito y a la toxicidad celular. Estas propiedades pueden definir las funciones de la iNOS en la inmunidad del huésped, lo que permite su participación en actividades antimicrobianas y antitumorales como parte del estallido oxidativo de los macrófagos. [17]
Se ha sugerido que la generación patológica de óxido nítrico a través del aumento de la producción de iNOS puede disminuir los latidos ciliares tubáricos y las contracciones del músculo liso y, por lo tanto, afectar el transporte del embrión, lo que puede dar lugar a un embarazo ectópico . [18]
La NOS endotelial (eNOS), también conocida como óxido nítrico sintasa 3 (NOS3), genera NO en los vasos sanguíneos y está involucrada en la regulación de la función vascular. El gen que codifica para eNOS se encuentra en el cromosoma 7. [15] Una NOS dependiente de Ca 2+ constitutiva proporciona una liberación basal de NO. eNOS se localiza en caveolas, un dominio de membrana plasmática compuesto principalmente por la proteína caveolina 1 , y en el aparato de Golgi. Estas dos poblaciones de eNOS son distintas, pero ambas son necesarias para la producción adecuada de NO y la salud celular. [19] La localización de eNOS en las membranas endoteliales está mediada por miristoilación N-terminal cotraduccional y palmitoilación postraduccional . [20] Como cofactor esencial para la óxido nítrico sintasa, la suplementación con tetrahidrobiopterina (BH4) ha mostrado resultados beneficiosos para el tratamiento de la disfunción endotelial en experimentos con animales y ensayos clínicos, aunque la tendencia de la BH4 a oxidarse a BH2 sigue siendo un problema. [21]
Se ha demostrado que la NOS bacteriana (bNOS) protege a las bacterias contra el estrés oxidativo, diversos antibióticos y la respuesta inmunitaria del huésped. La bNOS desempeña un papel clave en la transcripción de la superóxido dismutasa (SodA). Las bacterias en la fase logarítmica tardía que no poseen bNOS no logran regular positivamente la SodA, lo que desactiva las defensas contra el estrés oxidativo nocivo. Inicialmente, la bNOS puede haber estado presente para preparar a la célula para condiciones estresantes, pero ahora parece ayudar a proteger a las bacterias contra los antimicrobianos convencionales. Como aplicación clínica, se podría producir un inhibidor de la bNOS para disminuir la carga de bacterias grampositivas. [22] [23]
Las sintetasas de óxido nítrico producen NO al catalizar una oxidación de cinco electrones de un nitrógeno guanidino de L -arginina ( L -Arg). La oxidación de L -Arg a L -citrulina ocurre a través de dos reacciones de monooxigenación sucesivas que producen N ω -hidroxi- L -arginina (NOHLA) como intermediario. Se consumen 2 moles de O 2 y 1,5 moles de NADPH por cada mol de NO formado. [3]
Las enzimas existen como homodímeros. En eucariotas, cada monómero consta de dos regiones principales: un dominio de oxigenasa N-terminal, que pertenece a la clase de proteínas hemo-tiolato, y una reductasa C-terminal multidominio , que es homóloga a NADPH: citocromo P450 reductasa ( EC 1.6.2.4) y otras flavoproteínas. El dominio de unión de FMN es homólogo a las flavodoxinas, y el fragmento de dos dominios que contiene los sitios de unión de FAD y NADPH es homólogo a las flavodoxinas-NADPH reductasas. El enlace interdominio entre los dominios de oxigenasa y reductasa contiene una secuencia de unión de calmodulina . El dominio de oxigenasa es una jaula de lámina beta extendida única con sitios de unión para hemo y pterina.
Las NOS pueden ser hemoproteínas diméricas , dependientes de calmodulina o similares al citocromo p450 que contienen calmodulina , que combinan dominios catalíticos de reductasa y oxigenasa en un dímero, llevan tanto dinucleótido de flavina y adenina (FAD) como mononucleótido de flavina (FMN) y llevan a cabo una oxidación de 5 electrones del aminoácido no aromático arginina con la ayuda de tetrahidrobiopterina. [24]
Las tres isoformas (cada una de las cuales se presume que funciona como un homodímero durante la activación) comparten un dominio reductasa carboxilo-terminal homólogo a la reductasa del citocromo P450 . También comparten un dominio oxigenasa amino-terminal que contiene un grupo prostético hemo , que está unido en el medio de la proteína a un dominio de unión de calmodulina . La unión de calmodulina parece actuar como un "interruptor molecular" para permitir el flujo de electrones desde los grupos prostéticos de flavina en el dominio reductasa al hemo. Esto facilita la conversión de O 2 y L -arginina a NO y L -citrulina. El dominio oxigenasa de cada isoforma de NOS también contiene un grupo prostético BH 4 , que es necesario para la generación eficiente de NO. A diferencia de otras enzimas donde BH 4 se utiliza como fuente de equivalentes reductores y es reciclado por la dihidrobiopterina reductasa ( EC 1.5.1.33), BH 4 activa el O 2 unido al hemo donando un solo electrón, que luego es recapturado para permitir la liberación de óxido nítrico.
La primera óxido nítrico sintasa que se identificó se encontró en el tejido neuronal (NOS1 o nNOS); la NOS endotelial (eNOS o NOS3) fue la tercera en ser identificada. Originalmente se clasificaron como "de expresión constitutiva" y "sensibles al Ca 2+ ", pero ahora se sabe que están presentes en muchos tipos de células diferentes y que su expresión está regulada en condiciones fisiológicas específicas.
En NOS1 y NOS3, las concentraciones fisiológicas de Ca 2+ en las células regulan la unión de la calmodulina a los "dominios de cierre", iniciando así la transferencia de electrones desde las flavinas a las fracciones hemo . Por el contrario, la calmodulina permanece fuertemente unida a la isoforma inducible e insensible al Ca 2+ (iNOS o NOS2) incluso con una baja actividad intracelular de Ca 2+ , actuando esencialmente como una subunidad de esta isoforma.
El óxido nítrico puede regular por sí mismo la expresión y la actividad de la NOS. En concreto, se ha demostrado que el NO desempeña un importante papel regulador de retroalimentación negativa sobre la NOS3 y, por tanto, sobre la función de las células endoteliales vasculares. [25] Se ha demostrado que este proceso, conocido formalmente como S -nitrosación (y al que muchos en el campo se refieren como S -nitrosilación), inhibe de forma reversible la actividad de la NOS3 en las células endoteliales vasculares. Este proceso puede ser importante porque está regulado por las condiciones redox celulares y, por tanto, puede proporcionar un mecanismo para la asociación entre el "estrés oxidativo" y la disfunción endotelial. Además de la NOS3, se ha descubierto que tanto la NOS1 como la NOS2 están S -nitrosadas, pero la evidencia de la regulación dinámica de esas isoformas de la NOS mediante este proceso es menos completa [ cita requerida ] . Además, se ha demostrado que tanto NOS1 como NOS2 forman complejos ferrosos-nitrosílicos en sus grupos prostéticos del hemo que pueden actuar parcialmente para autoinactivar estas enzimas en determinadas condiciones [ cita requerida ] . El paso limitante de la velocidad para la producción de óxido nítrico puede ser la disponibilidad de L -arginina en algunos tipos de células. Esto puede ser particularmente importante después de la inducción de NOS2.
La ronopterina (VAS-203), también conocida como 4-amino-tetrahidrobiopterina (4-ABH 4 ), un análogo de BH 4 (un cofactor de NOS), es un inhibidor de NOS que se encuentra en desarrollo como agente neuroprotector para el tratamiento de la lesión cerebral traumática .[1] Otros inhibidores de NOS que se han investigado o se están investigando para un posible uso clínico incluyen cindunistat, A-84643, ONO-1714, L-NOARG , NCX-456, VAS-2381, GW-273629, NXN-462, CKD-712, KD-7040 y guanidinoetildisulfuro, TFPI entre otros.
