Los multímeros de MHC son formas oligoméricas de moléculas de MHC , diseñadas para identificar y aislar células T con alta afinidad por antígenos específicos entre un gran grupo de células T no relacionadas. [1] Los multímeros generalmente varían en tamaño desde dímeros hasta octámeros; sin embargo, algunas empresas utilizan cantidades aún mayores de MHC por multímero. Se pueden utilizar multímeros para presentar MHC de clase 1 , MHC de clase 2 o moléculas no clásicas (por ejemplo, CD1d ) de especies como monos, ratones y humanos.
Dado que los receptores de células T tienen una baja afinidad por sus homólogos del MHC, históricamente era problemático etiquetar las células T de forma eficaz utilizando interacciones únicas entre el MHC y las células T. [2] Sin embargo, en 1996 John Altman propuso utilizar un complejo de múltiples moléculas MHC para formar un enlace más estable entre las células T correspondientes. [3]
Los multímeros de MHC más utilizados son los tetrámeros. [3] Estos normalmente se producen biotinilando monómeros de MHC solubles, que normalmente se producen de forma recombinante en células eucariotas o bacterianas. Estos monómeros luego se unen a una columna vertebral, como la estreptavidina o la avidina , creando una estructura tetravalente. Estos esqueletos se conjugan con fluorocromos para aislar posteriormente las células T unidas mediante citometría de flujo . [4]
Los multímeros de MHC permiten un nivel de especificidad previamente inalcanzable en la detección y aislamiento de células T específicas de antígeno. Esta capacidad da lugar a varias aplicaciones clínicas. Los multímeros de MHC permiten la selección y proliferación ex vivo de células T específicas de antígenos virales o relacionados con tumores, que luego pueden reintroducirse para reforzar el sistema inmunológico. Los multímeros de MHC también se pueden utilizar para eliminar células T originarias de injertos en órganos trasplantados, ex vivo. Los multímeros de MHC también se pueden utilizar para eliminar células T dañinas o no deseadas in vivo, como aquellas que se dirigen a las células propias y provocan enfermedades autoinmunes. [4] [5] [6] Esta tecnología también puede influir en gran medida en la inmunoterapia contra el cáncer y el desarrollo de vacunas. [7]
Los tetrámeros del MHC constan de cuatro moléculas de MHC, un agente de tetramerización y una proteína marcada con fluorescencia (normalmente estreptavidina). También se han generado estreptavidinas con 6 o 12 sitios de unión para MHC. [8] Los tetrámeros de MHC se utilizan para identificar y marcar células T específicas mediante la unión específica de epítopos, lo que permite analizar la respuesta inmune específica de antígeno tanto en modelos animales como en humanos. [9] Los tetrámeros de MHC se desarrollaron originalmente utilizando moléculas de MHC de clase I para el reconocimiento de células T citotóxicas , [10] [11] pero durante la última década han permitido el reconocimiento de células T CD4 por una amplia variedad de antígenos. Los ensayos de tetrámeros se utilizan para el fenotipado y el recuento de células unicelulares, y ofrecen una ventaja importante sobre otros métodos, como ELISPOT y PCR unicelular, porque permiten la recuperación y el estudio adicional de células clasificadas. Como aplicación basada en citometría de flujo, los tetrámeros también son fáciles de usar y tienen un tiempo de ensayo corto, similar a los estudios de citometría de flujo basados en anticuerpos. [4]
Los tetrámeros del MHC se utilizan en estudios de inmunidad a patógenos y desarrollo de vacunas, en la evaluación de respuestas antitumorales, en estudios de desensibilización y seguimiento de alergias y en autoinmunidad. [4] [12] Proporcionan un medio ideal para caracterizar las células T que responden a una vacuna y se han utilizado para probar las respuestas de las células T en muchos sistemas de vacunas, incluida la influenza , [13] la fiebre amarilla , [14] la tuberculosis. , [15] VIH / VIS [16] y un gran número de ensayos de vacunas contra el cáncer, [17] incluidos el melanoma y la leucemia mieloide crónica . [18] Los tetrámeros de clase II se han utilizado para el análisis de una variedad de respuestas de células T CD4 humanas a patógenos, incluida la influenza A , Borrelia , virus de Epstein-Barr , CMV , Mycobacterium tuberculosis , virus linfotrópico T humano 1 , hepatitis C , ántrax. , virus del síndrome respiratorio agudo severo , virus del papiloma humano y VIH. [4] Se han desarrollado variantes de tetrámeros que, ya sea radiomarcadas o acopladas a una toxina como la saporina , pueden inyectarse en ratones vivos para modular o incluso agotar poblaciones de células T específicas. [19] [20] Los tetrámeros péptido-MHC también se han utilizado terapéuticamente. [21] Por ejemplo, las células T específicas de citomegalovirus se han enriquecido a altos niveles de pureza utilizando un enriquecimiento basado en perlas magnéticas para su uso como terapia para pacientes con trasplante de células madre . [12]
Los pentámeros constan de cinco grupos de cabeza de péptidos MHC, dispuestos en una configuración plana de modo que, a diferencia de los tetrámeros de MHC, todos los grupos de cabeza pueden contactar con la célula T CD8+. Los grupos principales están conectados mediante conectores flexibles a un dominio de multimerización en espiral , que a su vez está conectado a cinco etiquetas fluorescentes o de biotina. Los pentámeros están disponibles con etiquetado APC, R-PE o biotina, y también sin etiquetar con etiquetas separadas para almacenamiento a largo plazo. Los pentámeros ofrecen mayor brillo y avidez de tinción en comparación con otros reactivos multiméricos.
Los pentámeros de MHC se han utilizado en la detección de células T CD8+ específicas de antígeno en citometría de flujo [12] y se citan en más de 750 publicaciones revisadas por pares [1], incluidas varias en las revistas Nature [22] y Science . [23] [24] Los pentámeros de MHC también se pueden utilizar en la tinción de tejidos, [25] y en el aislamiento magnético de células T específicas de antígeno. [26]
Si bien los pentámeros están autorizados solo para uso en investigación, en 2009 se otorgó una dispensa especial para que un equipo los utilizara para aislar células T específicas del VEB para la transferencia madre-hija, para salvar la vida del linfoma asociado al VEB en la hija. [27]
Los pentámeros están disponibles para antígenos de las siguientes áreas de enfermedades: adenovirus , VHC , malaria , VIS , enfermedades autoinmunes , VIH , antígenos de trasplante, tripanosoma , cáncer , VPH , tuberculosis , clamidia , HTLV , vaccinia , CMV , influenza , VSV , EBV , LCMV. , VRS , virus del Nilo Occidental , VHB , Listeria , virus Sendai , fiebre amarilla . También se pueden encargar pentámeros de especificidad personalizada.
Actualmente, los pentámeros se utilizan en la investigación por parte del mundo académico, la industria y los médicos, y la investigación que utiliza pentámeros ha aparecido en los medios internacionales [2][3] en varias ocasiones.
Una forma de multímero de MHC desarrollado y registrado por la empresa de biotecnología danesa Immudex en 2002. Los reactivos de dextramero están marcados fluorescentemente con FITC, PE o APC y contienen moléculas de MHC unidas a una columna vertebral de dextrano , que se utilizan para detectar antígenos T-específicos. células en células líquidas y muestras de tejido sólido mediante citometría de flujo. Estas células T contienen receptores de células T (TCR) que reconocen un complejo MHC-péptido específico que se muestra en la superficie de las células presentadoras de antígenos, lo que permite la detección, el aislamiento y la cuantificación de estas poblaciones específicas de células T debido a una señal mejorada para -relación de ruido no presente en generaciones anteriores de multímeros. [3] [12] [28]
Los reactivos Dextramer ® se han desarrollado con una mayor cantidad de péptidos MHC para varios genes humanos, de ratón y de macaco rhesus involucrados en enfermedades que incluyen, entre otras: cáncer , VIH , virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), LCMV, virus del papiloma humano (VPH), poliomavirus BK , HTLV, hepatitis , micobacterias y enfermedad de injerto contra huésped .
La tecnología del dextramero se utiliza actualmente en la investigación académica y clínica debido a su mayor especificidad y afinidad de unión, lo que permite una mayor avidez por células T específicas y mejora la intensidad de la tinción. Esta ventaja es el resultado de la mayor capacidad de los dextrameros para unirse varias veces a una sola célula T, lo que mejora la estabilidad de esta interacción en comparación con otras tecnologías de multímeros, como los pentámeros y los tetrámeros. Otras aplicaciones incluyen la capacidad de aislar poblaciones de células T específicas de antígenos, así como la detección in situ mediante inmunohistoquímica (IHC) para diversos estados patológicos (por ejemplo, tumores sólidos). Por lo tanto, estos reactivos son importantes para el futuro desarrollo de fármacos y vacunas. [1] [12] [28] [29] [30]
Immudex desarrolló un ensayo CMV Dextramer ® para la detección exploratoria y la cuantificación de células T CD8+ en muestras de sangre, que cubre una amplia gama de epítopos para ayudar con la detección y el seguimiento de la progresión del CMV en entornos clínicos futuros. [31] Los reactivos MHC Dextramer ® están disponibles con moléculas MHC clase I y MHC clase II. [32]