La sacarosa fosforilasa ( EC 2.4.1.7) es una enzima importante en el metabolismo de la sacarosa y la regulación de otros intermediarios metabólicos. La sacarosa fosforilasa pertenece a la clase de las hexosiltransferasas . Más específicamente, se la ha colocado en la familia de las hidrolasas de glicósido retenedoras , aunque cataliza una transglicosidación en lugar de una hidrólisis. La sacarosa fosforilasa cataliza la conversión de sacarosa en D-fructosa y α-D-glucosa-1-fosfato . [1] Se ha demostrado en múltiples experimentos que la enzima cataliza esta conversión mediante un mecanismo de doble desplazamiento .
El método por el cual la sacarosa fosforilasa convierte la sacarosa en D-fructosa y alfa-D-glucosa-1-fosfato se ha estudiado en gran detalle. En la reacción, la sacarosa se une a la enzima, momento en el cual la fructosa es liberada por el complejo enzima-sustrato. Se obtiene un complejo covalente glucosa-enzima, con enlace beta entre un átomo de oxígeno en el grupo carboxilo de un residuo de aspartilo y C-1 de la glucosa. El complejo covalente se aisló experimentalmente por modificación química de la proteína usando NaIO4 después de la adición del sustrato , [2] [3] apoyando la hipótesis de que la reacción catalizada por la sacarosa fosforilasa procede a través del mecanismo de ping-pong . En el paso enzimático final, el enlace glucosídico se escinde a través de la reacción con un grupo fosfato , produciendo α-D-glucosa-1-fosfato.
En una reacción separada, la α-D-glucosa-1-fosfato se convierte en glucosa-6-fosfato por la acción de la fosfoglucomutasa . [4] La glucosa-6-fosfato es un intermediario extremadamente importante para varias vías en el cuerpo humano, incluyendo la glucólisis , la gluconeogénesis y la vía de las pentosas fosfato . [5] La función de la sacarosa fosforilasa es especialmente significativa debido al papel de la α-D-glucosa-1-fosfato en el metabolismo energético.
La estructura de la sacarosa fosforilasa se ha identificado en numerosos experimentos. La enzima consta de cuatro dominios principales, a saber, A, B, B' y C. Los dominios A, B' y C existen como dímeros alrededor del sitio activo. [6] Se encontró que el tamaño de la enzima, según lo determinado por centrifugación por sedimentación , era de 55 KDa, que consta de 488 aminoácidos. [7] Se ha demostrado que el activo contiene dos sitios de unión, uno designado como sitio de agua donde las moléculas hidroxílicas como 1,2-ciclohexanodiol y etilenglicol pueden unirse, y otro designado como el sitio aceptor donde se une la molécula de azúcar. Aunque la función del sitio de agua no se ha dilucidado por completo, la estabilidad de la enzima en soluciones acuosas indica que el sitio de agua puede estar involucrado en la hidrólisis del enlace glucosídico.
El sitio aceptor está rodeado por tres residuos activos que se han encontrado esenciales en la actividad enzimática. Utilizando ensayos mutagénicos específicos, se encontró que Asp-192 es el nucleófilo catalítico de la enzima, “atacando C-1 de la fracción glucosídica de la sacarosa”. [8] De hecho, la manipulación in vitro ha demostrado que la D-xilosa , la L-sorbosa y la L-arabinosa pueden reemplazar a la fructosa como aceptor glucosídico. [9] El único requisito de la molécula aceptora es que el grupo hidroxilo en el C-3 esté dispuesto en cis con respecto al átomo de oxígeno del enlace glucosídico. Glu-232 actúa como el catalizador ácido-base de Bronsted , donando un protón al grupo hidroxilo desplazado en C-1 del glucósido. [10]
Sin embargo, el residuo más significativo en la actividad enzimática es Asp-295. [11] Tras la escisión de la fracción fructofuranosilo de la sacarosa, la glucosa resultante forma un intermediario covalente con la enzima. La cadena lateral carboxilato de Asp-295 se enlaza con los grupos hidroxilo en C-2 y C-3 del residuo glucosilo. [11] Esta interacción se maximiza durante el estado de transición de este complejo covalente, lo que respalda el mecanismo de ping-pong. Finalmente, la fosforilación del residuo glucosilo en C-1 forma una carga positiva transitoria en el carbono glucosilo, lo que promueve la ruptura del enlace éster entre Asp-192 y el residuo de azúcar. [8] La escisión produce el producto, α-D-glucosa-1-fosfato.
Desde el descubrimiento y caracterización de la sacarosa fosforilasa, pocos experimentos documentados analizan los mecanismos de regulación de la enzima. Los métodos de regulación conocidos son transcripcionales y afectan la cantidad de enzima presente en un momento dado.
La regulación global de las moléculas de ADN que contienen el gen de la sacarosa fosforilasa se realiza mediante la represión por catabolitos . Descubiertos por primera vez en bacterias Gram-negativas , tanto el AMP cíclico (cAMP) como la proteína receptora de cAMP (CRP) funcionan en la regulación de la sacarosa fosforilasa. [1] El complejo cAMP-CRP que se forma cuando ambas moléculas se combinan actúa como un regulador positivo para la transcripción del gen de la sacarosa fosforilasa. El complejo se une a la región promotora para activar la transcripción, mejorando la creación de la sacarosa fosforilasa. [5]
La regulación genética de la sacarosa fosforilasa también la realizan los metabolitos . A través de la experimentación se sabe que los genes que codifican para la enzima sacarosa fosforilasa pueden ser inducidos por la sacarosa y la rafinosa . [12] La glucosa , por otro lado, reprime la transcripción del gen de la sacarosa fosforilasa. [12] Estos metabolitos sin duda funcionan de esta manera debido a sus implicaciones en el metabolismo celular.
Se han realizado pocas investigaciones sobre los métodos de regulación alostérica de la sacarosa fosforilasa, por lo que en este momento solo se puede plantear una hipótesis sobre la función de las moléculas alostéricas. Debido a la naturaleza de su función en las vías metabólicas, es probable que la sacarosa fosforilasa esté regulada adicionalmente por otros metabolitos comunes. [ cita requerida ] Por ejemplo, la presencia de ATP probablemente inhibiría la sacarosa fosforilasa, ya que el ATP es un producto de la vía catabólica. Por el contrario, el ADP probablemente estimularía la sacarosa fosforilasa para aumentar los niveles de ATP. Se necesitaría más investigación sobre el tema para apoyar o refutar estas ideas.
Como se mencionó anteriormente, la sacarosa fosforilasa es una enzima muy importante en el metabolismo. La reacción catalizada por la sacarosa fosforilasa produce los valiosos subproductos α-D-glucosa-1-fosfato y fructosa. La α-D-glucosa-1-fosfato puede ser convertida reversiblemente por la fosfoglucomutasa a glucosa-6-fosfato, [4] que es un intermediario importante utilizado en la glucólisis. Además, la fructosa puede ser convertida reversiblemente en fructosa 6-fosfato , [1] también encontrada en la vía glucolítica. De hecho, la fructosa-6-fosfato y la glucosa-6-fosfato pueden ser interconvertidas en la vía glucolítica por la fosfohexosa isomerasa . [5] El producto final de la glucólisis, el piruvato , tiene múltiples implicaciones en el metabolismo. Durante condiciones anaeróbicas, el piruvato puede ser convertido en lactato o etanol , dependiendo del organismo, proporcionando una fuente rápida de energía. En condiciones aeróbicas, el piruvato puede convertirse en acetil-CoA , que tiene muchos destinos posibles, incluido el catabolismo en el ciclo del ácido cítrico para el uso de energía y el anabolismo en la formación de ácidos grasos para el almacenamiento de energía. A través de estas reacciones, la sacarosa fosforilasa se vuelve importante en la regulación de las funciones metabólicas.
La regulación de la sacarosa fosforilasa también puede utilizarse para explicar su función en términos de consumo y conservación de energía. El complejo cAMP-CRP que mejora la transcripción del gen de la sacarosa fosforilasa (Reid y Abratt 2003) solo está presente cuando los niveles de glucosa son bajos. Por lo tanto, el propósito de la sacarosa fosforilasa puede vincularse a la necesidad de niveles más altos de glucosa, creados a través de su reacción. El hecho de que la glucosa actúe como un inhibidor de retroalimentación para prevenir la formación de la sacarosa fosforilasa [1] respalda aún más su papel catalítico en la creación de glucosa para uso o almacenamiento de energía.
La molécula de glucosa-6-fosfato creada a partir del producto original α-D-glucosa-1-fosfato también está involucrada en la vía de la pentosa fosfato . A través de una serie de reacciones, la glucosa-6-fosfato se puede convertir en ribosa-5-fosfato , que se utiliza para una variedad de moléculas como nucleótidos , coenzimas , ADN y ARN . [5] Estas conexiones revelan que la sacarosa fosforilasa también es importante para la regulación de otras moléculas celulares.
