Los constructos de Kode de Función-Espaciador-Lípido (FSL) (Tecnología Kode) son constructos de ingeniería de biosuperficies anfifáticos , dispersables en agua, que se pueden utilizar para diseñar la superficie de células , virus y organismos, o para modificar soluciones y superficies no biológicas con bioactivos. [1] [2] [3] Los constructos de Kode de FSL se incorporan de forma espontánea y estable a las membranas celulares. Los constructos de Kode de FSL con todas estas características mencionadas anteriormente también se conocen como constructos de Kode. [ 1] El proceso de modificación de superficies con constructos de Kode de FSL se conoce como "codificación" y las células "codificadas" resultantes [1] , los virus y los liposomas se conocen respectivamente como kodecitos [ 1 ] [4] y kodeviriones [1] [5]
Todas las superficies vivas están decoradas con una amplia gama de moléculas complejas, que son moduladores clave de las comunicaciones químicas y otras funciones como la protección, la adhesión , la infectividad , la apoptosis , etc. Las construcciones de Kode espaciador funcional-lípido (FSL) se pueden sintetizar para imitar los componentes bioactivos presentes en las superficies biológicas y luego volver a presentarlos de formas novedosas. [1] [2] La arquitectura de una construcción FSL Kode, como implícito en el nombre, consta de tres componentes: un grupo de cabeza funcional, un espaciador y una cola lipídica. [3] Esta estructura es análoga a una minifigura de Lego en el sentido de que tienen tres componentes estructurales, y cada componente tiene un propósito separado. [1] [2] En los ejemplos que se muestran en todas las figuras, se ha utilizado una " minifigura " de Lego para la analogía. Sin embargo, debe apreciarse que esto es simplemente una representación y que la verdadera similitud estructural varía significativamente entre las minifiguras de Lego y las construcciones FSL Kode (fig. 1) . El grupo funcional de un FSL es equivalente a la cabeza de una minifigura de Lego, ya que ambos están en la extremidad y llevan los componentes funcionales del personaje. El espaciador del FSL es equivalente al cuerpo de la minifigura de Lego y los brazos de la minifigura son representativos de las sustituciones que pueden diseñarse en la composición química del espaciador. El lípido del FSL lo ancla a las membranas lipídicas y le da al constructo FSL su naturaleza anfipática que puede hacer que se autoensamble. Debido a que la cola lipídica puede actuar directamente como un ancla, es análoga a las piernas de una minifigura de Lego.
El grupo funcional, el espaciador y los componentes de la cola lipídica del constructo FSL Kode pueden diseñarse individualmente, lo que da como resultado constructos FSL Kode con funciones biológicas específicas. [2] El grupo funcional de la cabeza suele ser el componente bioactivo del constructo y los diversos espaciadores y lípidos influyen y afectan su presentación, orientación y ubicación en una superficie. Un requisito fundamental para la definición de un constructo FSL Kode es que sea dispersable en agua y se incorpore de forma espontánea y estable a las membranas celulares. Otros bioconjugados lipídicos que incluyen componentes similares a los FSL pero que no tienen estas características no se denominan constructos de función-espaciador-lípido Kode. [2]
Fuente: [3]
Ya se han incorporado una amplia gama de grupos funcionales a las construcciones de FSL Kode. Entre ellos se incluyen:
Nota 1: Multimérico: la presentación del residuo F puede ser como multímeros con espaciamiento controlado y ser variable.
Nota 2: Masa: la masa que se puede anclar mediante construcciones de FSL Kode puede variar de 200 a >1x10 6 Da
Fuente: [3]
El espaciador es una parte integral del constructo FSL Kode y le otorga varias características importantes, incluida la dispersabilidad en agua . [2]
Fuente: [3]
La cola lipídica es esencial para permitir la inserción y retención de la membrana lipídica , pero también para otorgarle al constructo características anfifílicas que permiten el recubrimiento hidrofílico de la superficie (debido a la formación de capas bilipídicas ). Los diferentes lípidos de membrana que se pueden usar para crear FSL tienen diferentes características fisicoquímicas de membrana y, por lo tanto, pueden afectar la función biológica del FSL. Los lípidos en los constructos FSL Kode incluyen: [2]
Una de las funciones importantes de un constructo FSL es que puede optimizar la presentación de antígenos , tanto en superficies celulares como en membranas en fase sólida. Esta optimización se logra principalmente mediante el espaciador y, en segundo lugar, mediante la cola lipídica. En un inmunoensayo típico , el antígeno se deposita directamente sobre la superficie de la microplaca y se une a la superficie de forma aleatoria o en una orientación preferida según los residuos presentes en la superficie de este antígeno. Por lo general, este proceso de deposición no está controlado. Por el contrario, el constructo FSL Kode unido a una microplaca presenta el antígeno alejado de la superficie en una orientación con un alto nivel de exposición al medio ambiente. Además, los inmunoensayos típicos utilizan péptidos recombinantes en lugar de antígenos peptídicos discretos. Como el péptido recombinante es muchas veces más grande que el epítopo de interés, muchas secuencias de péptidos no deseadas y no deseadas también están representadas en la microplaca. Estas secuencias adicionales pueden incluir secuencias relacionadas con microbios no deseadas (según lo determinado por un análisis BLAST ) que pueden causar problemas de reactividad cruzada de bajo nivel. A menudo, el mecanismo por el cual un inmunoensayo es capaz de superar esta actividad de bajo nivel es diluir el suero de modo que no se observen los anticuerpos reactivos microbianos de bajo nivel , y solo los anticuerpos específicos de alto nivel den como resultado un resultado interpretable. Por el contrario, las construcciones FSL Kode suelen utilizar fragmentos de péptidos seleccionados específicamente (hasta 40 aminoácidos), [15] [18] superando así la reactividad cruzada con secuencias microbianas y permitiendo el uso de suero sin diluir (lo que aumenta la sensibilidad ).
El componente F se puede mejorar aún más presentándolo en formatos multiméricos y con espaciado específico. Los cuatro tipos de formato multimérico incluyen unidades repetitivas lineales, unidades repetitivas lineales con espaciado, grupos y ramificaciones (Fig. 4) .
El constructo FSL Kode, por la naturaleza de su composición al poseer regiones tanto hidrofóbicas como hidrofílicas, es anfifílico (o anfipático). Esta característica determina la forma en que el constructo interactuará con las superficies. Cuando están presentes en una solución, pueden formar micelas simples o adoptar estructuras de bicapa más complejas con dos ejemplos simplistas que se muestran en la Fig. 5a . Se esperan estructuras más complejas. La naturaleza real de las micelas FSL no se ha determinado. Sin embargo, con base en la función estructural normal de las micelas, se espera que esté determinada en parte por la combinación de grupo funcional, espaciador y lípido junto con temperatura, concentración , tamaño e hidrofobicidad/hidrofilicidad para cada tipo de constructo FSL Kode.
Los recubrimientos superficiales se producirán mediante dos mecanismos teóricos, el primero es la interacción hidrófoba directa de la cola lipídica con una superficie hidrófoba que da como resultado una monocapa de FSL en la superficie (Fig. 5b) . La unión hidrófoba de la FSL se producirá a través de su cola lipídica hidrófoba que interactúa directamente con la superficie hidrófoba ( lipófila ). El segundo recubrimiento superficial se producirá mediante la formación de bicapas, ya que la cola lipídica no puede reaccionar con la superficie hidrófila. En este caso, los lípidos inducirán la formación de una bicapa, cuya superficie será hidrófila. Esta membrana hidrófila interactuará entonces directamente con la superficie hidrófila y probablemente encapsulará fibras . Esta unión de bicapa hidrófila es el mecanismo esperado por el cual las FSL pueden unirse a membranas fibrosas como el papel [19] y las fibras de vidrio (Fig. 5c) y (Fig. 9) .
Después de etiquetar la superficie con los bioactivos F seleccionados, los constructos estarán presentes y orientados en la superficie de la membrana. Se espera que el FSL sea altamente móvil dentro de la membrana y la elección de la cola lipídica afectará su partición relativa dentro de la membrana. [2] [7] Se espera que el constructo, a menos que tenga un comportamiento flip-flop, permanezca presente en la superficie. Sin embargo, la modificación no es permanente en células vivas y los constructos se perderán (consumirán) a una tasa proporcional a la actividad en la membrana y la tasa de división de la célula (con las células muertas permaneciendo altamente etiquetadas). [1] Además, cuando están presentes in vivo con lípidos séricos, los FSL se eluirán de la membrana al plasma a una tasa de aproximadamente 1% por hora. [5] [10] En células fijas o células inactivas (por ejemplo, glóbulos rojos) almacenadas en medios libres de suero, los constructos se retienen normalmente. [1]
Los liposomas se codifican fácilmente simplemente añadiendo construcciones FSL Kode a la preparación. El contacto de los liposomas codificados con microplacas u otras superficies puede provocar el marcado de la superficie de la microplaca.
Los recubrimientos superficiales no biológicos se producen a través de dos mecanismos: el primero es la interacción hidrófoba directa de la cola lipídica con una superficie hidrófoba, lo que da como resultado una monocapa de FSL en la superficie. El segundo recubrimiento superficial se produce mediante la formación de bicapas, que probablemente encapsulen fibras o se produzcan a través del grupo F hidrófilo. Este es el mecanismo esperado por el que los FSL se unen a membranas fibrosas como el papel [19] y las fibras de vidrio. Un estudio reciente ha descubierto que, cuando se optimizan las construcciones de FSL Kode, se puede glicosilar en unos pocos segundos casi cualquier superficie no biológica, incluidos metales, vidrio, plásticos, cauchos y otros polímeros. [20]
Las características tecnológicas de las construcciones FSL Kode y el proceso de codificación se pueden resumir de la siguiente manera:
Las construcciones FSL tienen una amplia gama de usos y se han utilizado para modificar lo siguiente:
Las construcciones de FSL, cuando están en solución (solución salina ) y en contacto, se incorporarán espontáneamente a las membranas celulares y virales. [1] La metodología implica simplemente preparar una solución de construcciones de FSL en el rango de 1–1000 μg / mL . La concentración real dependerá de la construcción y la cantidad de construcción requerida en la membrana. Se agrega una parte de la solución de FSL a una parte de células (hasta un 100% de suspensión ) y se incuban a una temperatura establecida dentro del rango de 4–37 °C (39–99 °F) dependiendo de la compatibilidad de temperatura de las células que se están modificando. Cuanto mayor sea la temperatura, más rápida será la tasa de inserción de FSL en la membrana. Para los glóbulos rojos, a 37 °C de incubación durante 2 horas se logra >95% de inserción consiguiendo al menos un 50% de inserción en 20 minutos. En general, el tiempo de inserción de FSL de 4 horas a temperatura ambiente o 20 horas a 4 °C arroja resultados similares a 1 hora a 37 °C para FSL basados en carbohidratos que se insertan en glóbulos rojos. [1] No es necesario lavar los kodecitos o kodeviriones resultantes, sin embargo, esta opción debe considerarse si se utiliza un exceso de construcción de FSL en el proceso de codificación.
Los constructos FSL Kode se han utilizado para investigación y desarrollo de productos de diagnóstico y actualmente se están investigando como posibles agentes terapéuticos .
Los FSL se han utilizado para crear codecitos de glóbulos rojos humanos que se han utilizado para detectar e identificar aloanticuerpos de grupos sanguíneos [13] [14] [15] como imitadores del subgrupo ABO , [11] sistemas de control de calidad ABO, [4] kits de enseñanza serológica [12] y un diagnóstico de sífilis . [21] Los codecitos también han demostrado que FSL-FLRO4 es un reactivo adecuado para etiquetar glóbulos rojos empaquetados (PRBC) en cualquier momento durante el almacenamiento de rutina y buscan facilitar el desarrollo de inmunoensayos y modelos de transfusión enfocados en abordar los mecanismos involucrados en la inmunomodulación relacionada con la transfusión (TRIM). [17] Los codecitos murinos se han utilizado experimentalmente para determinar la supervivencia celular in vivo , [10] y crear reacciones de transfusión modelo . [9] [10] Los codecitos de pez cebra se han utilizado para determinar la migración celular in vivo en tiempo real . [16] Los codecitos se han utilizado para crear diagnósticos de influenza. [2] Los códecitos modificados con FSL-GB3 no pudieron ser infectados por el virus VIH . [7] [23]
Los kodeviriones son virus modificados por FSL. Se han utilizado varias construcciones de kode FSL para etiquetar virus y facilitar su visualización por citometría de flujo [5] y para rastrear su distribución en tiempo real en modelos animales. [5] También se han utilizado para modificar la superficie de los virus con la intención de utilizarlos como diana para adherirse a tumores ( oncolíticos ). [5]
Los kodesomas son liposomas que han sido decorados con construcciones FSL Kode. Estos se han utilizado para depositar construcciones FSL en microplacas para crear ensayos de diagnóstico . También tienen potencial para uso terapéutico. [24]
Estas son soluciones que contienen construcciones FSL Kode donde la construcción existirá como una dispersión microcelular clara. FSL-GB3 como solución/gel se ha utilizado para inhibir la infección por VIH [7] y para neutralizar la toxina Shiga . [7] El grupo sanguíneo A de FSL como solución se ha utilizado para neutralizar anticuerpos circulantes en un modelo de ratón y permitir la transfusión de grupo sanguíneo A incompatible ( kodecitos murinos ). [9] Este experimento modelo se utilizó para demostrar el potencial de los FSL para neutralizar anticuerpos circulantes y permitir la transfusión de sangre o el trasplante de órganos incompatibles . [19]
Todas las construcciones FSL Kode se dispersan en agua y, por lo tanto, son compatibles con impresoras de inyección de tinta . Las construcciones FSL se pueden imprimir con una impresora de inyección de tinta de escritorio estándar directamente sobre papel para crear inmunoensayos. [19] Un cartucho de tinta vacío se llena con una construcción FSL y se imprimen palabras, códigos de barras o gráficos. Se adhiere una plantilla de Perspex a la superficie para crear pocillos de reacción. El método es entonces un procedimiento EIA estándar , pero no se requiere el bloqueo del suero y se puede utilizar suero sin diluir. Un procedimiento típico es el siguiente: agregar suero, incubar, lavar por inmersión, agregar conjugado EIA secundario, incubar, lavar, agregar sustrato precipitante NBT / BCIP y detener la reacción cuando se revela por lavado (Fig. 9) . El resultado es estable durante años.
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