La tomografía electrónica criogénica ( crioET ) es una técnica de imágenes utilizada para reconstruir volúmenes tridimensionales de muestras de alta resolución (~1–4 nm), a menudo (pero no limitado a) macromoléculas y células biológicas . [1] [2] cryoET es una aplicación especializada de criomicroscopía electrónica de transmisión (CryoTEM) en la que se obtienen imágenes de las muestras a medida que se inclinan, lo que da como resultado una serie de imágenes 2D que se pueden combinar para producir una reconstrucción 3D, similar a una tomografía computarizada. del cuerpo humano. A diferencia de otras técnicas de tomografía electrónica , las muestras se obtienen en condiciones criogénicas (< −150 °C). En el caso del material celular, la estructura está inmovilizada en hielo vítreo no cristalino , lo que permite obtener imágenes sin deshidratación ni fijación química , que de otro modo alteraría o distorsionaría las estructuras biológicas. [3] [4]
En microscopía electrónica (EM), las muestras se obtienen imágenes en alto vacío . Un vacío de este tipo es incompatible con muestras biológicas como las células; el agua herviría y la diferencia de presión haría explotar la celda. Por lo tanto, en las técnicas EM a temperatura ambiente, las muestras se preparan mediante fijación y deshidratación. Sin embargo, otro método para estabilizar muestras biológicas es congelarlas ( microscopía crioelectrónica o crioEM). Como en otras técnicas de criomicroscopía electrónica, las muestras para crioET (normalmente células pequeñas como bacterias , arqueas o virus ) se preparan en medios acuosos estándar y se aplican a una rejilla EM. Luego, la rejilla se sumerge en un criógeno (generalmente etano líquido ) de manera tan eficiente que las moléculas de agua no tienen tiempo de reorganizarse en una red cristalina . [3] El estado de agua resultante se llama "hielo vítreo" y preserva las estructuras celulares nativas, como las membranas lipídicas , que normalmente serían destruidas por la congelación. Posteriormente, las muestras congeladas por inmersión se mantienen a temperaturas de nitrógeno líquido mediante almacenamiento e imágenes, de modo que el agua nunca se calienta lo suficiente como para cristalizar.
Se obtienen imágenes de las muestras en un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Como en otras técnicas de tomografía electrónica , la muestra se inclina en diferentes ángulos con respecto al haz de electrones (normalmente cada 1 o 2 grados, desde aproximadamente −60° a +60°), y se adquiere una imagen en cada ángulo. [5] Esta serie inclinada de imágenes puede luego reconstruirse computacionalmente en una vista tridimensional del objeto de interés. [6] Esto se llama tomografía o reconstrucción tomográfica .
Uno de los beneficios más comúnmente citados de la crioET es la capacidad de reconstruir volúmenes 3D de objetos individuales (proteínas, células, etc. ) en lugar de necesitar múltiples copias de la muestra en métodos cristalográficos u otros métodos de imágenes crioEM como el análisis de una sola partícula . [7] CryoET se considera un método in situ cuando se utiliza en una celda u otro sistema no perturbado, ya que la congelación por inmersión fija la muestra en su lugar lo suficientemente rápido como para causar cambios mínimos en el posicionamiento atómico. [8]
En la microscopía electrónica de transmisión (TEM), debido a que los electrones interactúan fuertemente con la materia , las muestras deben mantenerse muy delgadas para no oscurecerlas debido a múltiples eventos de dispersión elástica . Por lo tanto, en crioET, las muestras generalmente tienen un espesor inferior a ~500 nm. Por esta razón, la mayoría de los estudios de crioET se han centrado en complejos macromoleculares purificados , virus o células pequeñas como las de muchas especies de Bacterias y Archaea. [1] Por ejemplo, la crioET se ha utilizado para comprender la encapsulación de nanopartículas de jaula de proteínas de 12 nm de tamaño dentro de nanopartículas similares a virus de 60 nm de tamaño. [9]
Las células más grandes, e incluso los tejidos, se pueden preparar para la crioET mediante adelgazamiento, ya sea mediante criosección o mediante molienda con haz de iones enfocados (FIB). En la criosección, se seccionan bloques congelados de células o tejido en muestras delgadas con un criomicrótomo . [11] En la molienda FIB, las muestras congeladas por inmersión se exponen a un haz enfocado de iones, generalmente galio , que elimina con precisión el material de la parte superior e inferior de una muestra, dejando una laminilla delgada adecuada para imágenes crioET. [12]
Para estructuras que están presentes en múltiples copias en uno o múltiples tomogramas, se puede obtener una resolución más alta (incluso ≤1 nm) mediante un promedio de subtomograma. [13] [14] De manera similar al análisis de partículas individuales, el promedio de subtomogramas combina computacionalmente imágenes de objetos idénticos para aumentar la relación señal-ruido .
Se sabe que la microscopía electrónica descompone rápidamente las muestras biológicas en comparación con las muestras de la ciencia de materiales y la física debido al daño por radiación . [15] En la mayoría de los otros métodos basados en microscopía electrónica para obtener imágenes de muestras biológicas, la combinación de la señal de muchas copias de muestras diferentes ha sido la forma general de superar este problema ( por ejemplo , cristalografía, análisis de partículas individuales). En crioET, en lugar de tomar muchas imágenes de diferentes copias de muestra, se toman muchas imágenes de un área. En consecuencia, la fluencia (número de electrones impartidos por unidad de área) en la muestra es entre 2 y 5 veces mayor que en el análisis de una sola partícula. [16] La tomografía en materiales mucho más resistentes permite una resolución drásticamente mayor que las imágenes biológicas típicas, lo que sugiere que el daño por radiación es la mayor limitación de la crioET de muestras biológicas. [7] [17]
La fuerte interacción de los electrones con la materia también da como resultado un efecto de resolución anisotrópica. A medida que la muestra se inclina durante la toma de imágenes, el haz de electrones interactúa con una muestra aparente más gruesa a lo largo del eje óptico del microscopio en ángulos de inclinación más altos. En la práctica, los ángulos de inclinación superiores a aproximadamente 60-70° no proporcionan mucha información y, por lo tanto, no se utilizan. Esto da como resultado una "cuña faltante" de información en la tomografía final que disminuye la resolución paralela al haz de electrones. [6]
El término "cuña faltante" se origina en la vista de la transformada de Fourier del tomograma, donde es evidente una cuña vacía debido a que la muestra no se inclina a 90°. La cuña faltante da como resultado una falta de resolución en la profundidad de la muestra, ya que la información faltante se encuentra principalmente a lo largo del eje z. La cuña faltante también es un problema en la cristalografía electrónica 3D , donde generalmente se resuelve fusionando múltiples conjuntos de datos que se superponen entre sí o mediante expansión de simetría cuando sea posible. [15] Ambas soluciones se deben a la naturaleza de la cristalografía, por lo que ninguna se puede aplicar a la tomografía.
Un obstáculo importante en la crioET es la identificación de estructuras de interés dentro de entornos celulares complicados. Soluciones como la microscopía óptica de criofluorescencia correlacionada [ 19] y la microscopía óptica de superresolución (por ejemplo, crio-PALM [20] ) se pueden integrar con la crioET. En estas técnicas, una muestra que contiene una proteína de interés marcada con fluorescencia se congela por inmersión y primero se obtienen imágenes en un microscopio óptico equipado con un escenario especial para permitir que la muestra se mantenga a temperaturas de subcristalización (< −150 °C). Se identifica la ubicación de la señal fluorescente y la muestra se transfiere al CryoTEM, donde luego se obtienen imágenes de la misma ubicación en alta resolución mediante crioET.