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Microscopía

Imagen de polen obtenida mediante microscopio electrónico de barrido (colores falsos)
Examen microscópico en un laboratorio bioquímico.

La microscopía es el campo técnico que utiliza microscopios para observar objetos y áreas de objetos que no se pueden ver a simple vista (objetos que no están dentro del rango de resolución del ojo normal). [1] Existen tres ramas bien conocidas de la microscopía: la microscopía óptica , la electrónica y la de sonda de barrido , junto con el campo emergente de la microscopía de rayos X. [ cita requerida ]

La microscopía óptica y la microscopía electrónica implican la difracción , reflexión o refracción de la radiación electromagnética /haces de electrones que interactúan con la muestra , y la recolección de la radiación dispersa u otra señal para crear una imagen. Este proceso puede llevarse a cabo mediante la irradiación de campo amplio de la muestra (por ejemplo, microscopía óptica estándar y microscopía electrónica de transmisión ) o mediante el barrido de un haz fino sobre la muestra (por ejemplo, microscopía de barrido láser confocal y microscopía electrónica de barrido ). La microscopía de sonda de barrido implica la interacción de una sonda de barrido con la superficie del objeto de interés. El desarrollo de la microscopía revolucionó la biología , dio origen al campo de la histología y, por lo tanto, sigue siendo una técnica esencial en las ciencias de la vida y la física . La microscopía de rayos X es tridimensional y no destructiva, lo que permite la obtención de imágenes repetidas de la misma muestra para estudios in situ o 4D, y proporciona la capacidad de "ver dentro" de la muestra que se está estudiando antes de sacrificarla por técnicas de mayor resolución. Un microscopio de rayos X 3D utiliza la técnica de tomografía computarizada ( microCT ), que rota la muestra 360 grados y reconstruye las imágenes. La TC se realiza normalmente con una pantalla plana. Un microscopio de rayos X 3D emplea una gama de objetivos, por ejemplo, de 4X a 40X, y también puede incluir un panel plano.

Historia

Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723)

El campo de la microscopía ( microscopía óptica ) se remonta al menos al siglo XVII. Los primeros microscopios, lupas de una sola lente con aumento limitado, datan al menos del uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII [2] pero los microscopios compuestos más avanzados aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620 [3] [4] Los primeros practicantes de la microscopía incluyen a Galileo Galilei , quien descubrió en 1610 que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños de cerca [5] [6] y Cornelis Drebbel , quien puede haber inventado el microscopio compuesto alrededor de 1620. [7] [8] Antonie van Leeuwenhoek desarrolló un microscopio simple de muy alto aumento en la década de 1670 y a menudo se lo considera el primer microscopista y microbiólogo reconocido . [9] [10]

Microscopía óptica

Microscopio estereoscópico

La microscopía óptica o de luz implica pasar la luz visible transmitida o reflejada a través de la muestra a través de una sola lente o múltiples lentes para permitir una vista ampliada de la muestra. [11] La imagen resultante puede ser detectada directamente por el ojo, fotografiada en una placa fotográfica o capturada digitalmente . La lente única con sus accesorios, o el sistema de lentes y equipo de imágenes, junto con el equipo de iluminación apropiado, la platina de muestra y el soporte, componen el microscopio óptico básico. El desarrollo más reciente es el microscopio digital , que utiliza una cámara CCD para enfocar el objeto de interés. La imagen se muestra en una pantalla de computadora, por lo que los oculares son innecesarios. [12]

Limitaciones

Las limitaciones de la microscopía óptica estándar ( microscopía de campo brillante ) radican en tres áreas:

Las células vivas, en particular, generalmente carecen de suficiente contraste para ser estudiadas con éxito, ya que las estructuras internas de la célula son incoloras y transparentes. La forma más común de aumentar el contraste es teñir las estructuras con colorantes selectivos, pero esto a menudo implica matar y fijar la muestra. [15] La tinción también puede introducir artefactos , que son detalles estructurales aparentes que son causados ​​por el procesamiento de la muestra y, por lo tanto, no son características de la muestra. En general, estas técnicas hacen uso de diferencias en el índice de refracción de las estructuras celulares. La microscopía de campo claro es comparable a mirar a través de una ventana de vidrio: uno no ve el vidrio sino simplemente la suciedad en el vidrio. Hay una diferencia, ya que el vidrio es un material más denso, y esto crea una diferencia en la fase de la luz que pasa a través. El ojo humano no es sensible a esta diferencia de fase, pero se han ideado soluciones ópticas inteligentes para cambiar esta diferencia de fase en una diferencia de amplitud (intensidad de la luz). [ cita requerida ]

Técnicas

Para mejorar el contraste de la muestra o resaltar las estructuras de la misma, se deben utilizar técnicas especiales. Existe una gran variedad de técnicas de microscopía para aumentar el contraste o etiquetar una muestra.

Campo brillante

La microscopía de campo claro es la más sencilla de todas las técnicas de microscopía óptica. La iluminación de la muestra se realiza mediante luz blanca transmitida, es decir, se ilumina desde abajo y se observa desde arriba. Las limitaciones incluyen el bajo contraste de la mayoría de las muestras biológicas y la baja resolución aparente debido a la borrosidad del material desenfocado. La simplicidad de la técnica y la preparación mínima de la muestra requerida son ventajas significativas. [ cita requerida ]

Iluminación oblicua

El uso de iluminación oblicua (lateral) le da a la imagen una apariencia tridimensional y puede resaltar características que de otro modo serían invisibles. Una técnica más reciente basada en este método es el contraste de modulación de Hoffmann , un sistema que se encuentra en los microscopios invertidos para su uso en cultivos celulares. La iluminación oblicua mejora el contraste incluso en muestras claras; sin embargo, debido a que la luz ingresa fuera del eje, la posición de un objeto parecerá cambiar a medida que se cambia el enfoque. Esta limitación hace que técnicas como el seccionamiento óptico o la medición precisa en el eje z sean imposibles.

Campo oscuro

La microscopía de campo oscuro es una técnica para mejorar el contraste de muestras transparentes y sin teñir. [16] La iluminación de campo oscuro utiliza una fuente de luz cuidadosamente alineada para minimizar la cantidad de luz transmitida directamente (no dispersa) que ingresa al plano de la imagen, recogiendo solo la luz dispersada por la muestra. El campo oscuro puede mejorar drásticamente el contraste de la imagen, especialmente de objetos transparentes, al tiempo que requiere poca configuración del equipo o preparación de la muestra. Sin embargo, la técnica sufre de baja intensidad de luz en la imagen final de muchas muestras biológicas y continúa viéndose afectada por una baja resolución aparente.

Una diatomea bajo la iluminación de Rheinberg

La iluminación de Rheinberg es una variante de la iluminación de campo oscuro en la que se insertan filtros transparentes y de colores justo antes del condensador, de modo que los rayos de luz con una apertura alta tienen un color diferente al de los rayos con una apertura baja (es decir, el fondo de la muestra puede ser azul mientras que el objeto aparece rojo autoluminoso). Son posibles otras combinaciones de colores, pero su eficacia es bastante variable. [17]

Tinción por dispersión

La tinción por dispersión es una técnica óptica que produce una imagen coloreada de un objeto incoloro. Se trata de una técnica de tinción óptica que no requiere colorantes ni colorantes para producir un efecto de color. Existen cinco configuraciones de microscopio diferentes que se utilizan en la técnica más amplia de tinción por dispersión. Estas incluyen tinción por línea de Becke de campo claro, oblicua, de campo oscuro, de contraste de fase y por dispersión de detención de objetivo.

Contraste de fase

Micrografía óptica de contraste de fases de cartílago hialino no descalcificado que muestra condrocitos y orgánulos , lagunas y matriz extracelular.
En microscopía electrónica : imágenes de contraste de fases

Las técnicas más sofisticadas mostrarán diferencias proporcionales en la densidad óptica. El contraste de fases es una técnica ampliamente utilizada que muestra las diferencias en el índice de refracción como diferencia de contraste. Fue desarrollado por el físico holandés Frits Zernike en la década de 1930 (por lo que recibió el Premio Nobel en 1953). El núcleo de una célula, por ejemplo, se verá oscuro contra el citoplasma circundante. El contraste es excelente, pero no se debe utilizar con objetos gruesos. Con frecuencia, se forma un halo incluso alrededor de objetos pequeños, que oscurece los detalles. El sistema consta de un anillo circular en el condensador, que produce un cono de luz. Este cono se superpone a un anillo de tamaño similar dentro del objetivo de fase. Cada objetivo tiene un anillo de tamaño diferente, por lo que para cada objetivo debe elegirse una configuración de condensador diferente. El anillo en el objetivo tiene propiedades ópticas especiales: en primer lugar, reduce la intensidad de la luz directa, pero lo que es más importante, crea una diferencia de fase artificial de aproximadamente un cuarto de longitud de onda. A medida que las propiedades físicas de esta luz directa han cambiado, se produce una interferencia con la luz difractada, lo que da como resultado la imagen de contraste de fases. Una desventaja de la microscopía de contraste de fases es la formación de halos (anillo de luz y halo).

Contraste de interferencia diferencial

El uso del contraste de interferencia es superior y mucho más costoso . Las diferencias en la densidad óptica se mostrarán como diferencias en el relieve. Un núcleo dentro de una célula se mostrará como un glóbulo en el sistema de contraste de interferencia diferencial más utilizado según Georges Nomarski . Sin embargo, hay que tener en cuenta que se trata de un efecto óptico y que el relieve no se parece necesariamente a la forma real. El contraste es muy bueno y la abertura del condensador se puede utilizar completamente abierta, lo que reduce la profundidad de campo y maximiza la resolución.

El sistema consta de un prisma especial ( prisma de Nomarski , prisma de Wollaston ) en el condensador que divide la luz en un haz ordinario y otro extraordinario. La diferencia espacial entre los dos haces es mínima (menor que la resolución máxima del objetivo). Después de pasar por la muestra, los haces se reúnen mediante un prisma similar en el objetivo.

En una muestra homogénea, no hay diferencia entre los dos haces y no se genera contraste. Sin embargo, cerca de un límite refractivo (por ejemplo, un núcleo dentro del citoplasma), la diferencia entre el haz ordinario y el extraordinario generará un relieve en la imagen. El contraste de interferencia diferencial requiere una fuente de luz polarizada para funcionar; se deben colocar dos filtros polarizadores en la trayectoria de la luz, uno debajo del condensador (el polarizador) y el otro encima del objetivo (el analizador).

Nota: En los casos en que el diseño óptico de un microscopio produce una separación lateral apreciable de los dos haces tenemos el caso de la microscopía de interferencia clásica , que no da como resultado imágenes en relieve, pero que sin embargo puede utilizarse para la determinación cuantitativa de masas-espesores de objetos microscópicos.

Reflexión de interferencia

Otra técnica que utiliza interferencias es la microscopía de reflexión por interferencia (también conocida como contraste de interferencia reflejada o RIC). Se basa en la adhesión celular al portaobjetos para producir una señal de interferencia. Si no hay células adheridas al vidrio, no habrá interferencia.

La microscopía de reflexión por interferencia se puede obtener utilizando los mismos elementos que se utilizan en la DIC, pero sin los prismas. Además, la luz que se detecta se refleja y no se transmite como ocurre cuando se utiliza la DIC.

Fluorescencia

Las imágenes también pueden contener artefactos . Esta es una micrografía de fluorescencia de barrido láser confocal de la antera de berro de Tallin (parte del estambre ). La imagen muestra, entre otras cosas, una bonita estructura de color rojo que fluye en forma de collar justo debajo de la antera. Sin embargo, un estambre de berro de Tallin intacto no tiene dicho collar, se trata de un artefacto de fijación: el estambre se ha cortado por debajo del marco de la imagen y la epidermis (capa superior de células) del tallo del estambre se ha desprendido, formando una estructura no característica. Foto: Heiti Paves de la Universidad Tecnológica de Tallin .

Cuando ciertos compuestos se iluminan con luz de alta energía, emiten luz de menor frecuencia. Este efecto se conoce como fluorescencia . A menudo, las muestras muestran su imagen de autofluorescencia característica , en función de su composición química.

Este método es de importancia crítica en las ciencias de la vida modernas, ya que puede ser extremadamente sensible, permitiendo la detección de moléculas individuales. Se pueden utilizar muchos tintes fluorescentes para teñir estructuras o compuestos químicos. Un método poderoso es la combinación de anticuerpos acoplados a un fluoróforo como en la inmunotinción . Ejemplos de fluoróforos comúnmente utilizados son la fluoresceína o la rodamina .

Los anticuerpos pueden fabricarse a medida para un compuesto químico. Por ejemplo, una estrategia que se utiliza a menudo es la producción artificial de proteínas, basándose en el código genético (ADN). Estas proteínas pueden utilizarse para inmunizar conejos, formando anticuerpos que se unen a la proteína. A continuación, los anticuerpos se acoplan químicamente a un fluoróforo y se utilizan para rastrear las proteínas en las células en estudio.

Se han desarrollado proteínas fluorescentes de alta eficiencia como la proteína fluorescente verde (GFP) utilizando la técnica de biología molecular de fusión génica , un proceso que vincula la expresión del compuesto fluorescente a la de la proteína diana. Esta proteína fluorescente combinada es, en general, no tóxica para el organismo y rara vez interfiere con la función de la proteína en estudio. Las células u organismos modificados genéticamente expresan directamente las proteínas marcadas con fluorescencia, lo que permite el estudio de la función de la proteína original in vivo .

El crecimiento de los cristales de proteína da como resultado cristales de proteína y de sal. Ambos son incoloros y microscópicos. La recuperación de los cristales de proteína requiere imágenes que pueden realizarse mediante la fluorescencia intrínseca de la proteína o mediante microscopía de transmisión. Ambos métodos requieren un microscopio ultravioleta, ya que las proteínas absorben luz a 280 nm. Las proteínas también fluorescen a aproximadamente 353 nm cuando se excitan con luz de 280 nm. [18]

Dado que la emisión de fluorescencia difiere en longitud de onda (color) de la luz de excitación, una imagen fluorescente ideal muestra solo la estructura de interés que fue marcada con el colorante fluorescente. Esta alta especificidad condujo al uso generalizado de la microscopía óptica de fluorescencia en la investigación biomédica. Se pueden utilizar diferentes colorantes fluorescentes para teñir diferentes estructuras biológicas, que luego se pueden detectar simultáneamente, sin dejar de ser específicas debido al color individual del colorante.

Para impedir que la luz de excitación llegue al observador o al detector, se necesitan conjuntos de filtros de alta calidad. Estos suelen constar de un filtro de excitación que selecciona el rango de longitudes de onda de excitación , un espejo dicroico y un filtro de emisión que bloquea la luz de excitación. La mayoría de los microscopios de fluorescencia se utilizan en el modo de iluminación epi (iluminación y detección desde un lado de la muestra) para reducir aún más la cantidad de luz de excitación que entra en el detector.

Ver también: microscopio de fluorescencia de reflexión interna total Neurociencia

Confocal

La microscopía confocal de barrido láser utiliza un haz láser enfocado (p. ej., 488 nm) que se escanea a través de la muestra para excitar la fluorescencia de manera punto por punto. La luz emitida se dirige a través de un orificio para evitar que la luz desenfocada llegue al detector, normalmente un tubo fotomultiplicador . La imagen se construye en una computadora, trazando las intensidades de fluorescencia medidas de acuerdo con la posición del láser de excitación. En comparación con la iluminación completa de la muestra, la microscopía confocal brinda una resolución lateral ligeramente superior y mejora significativamente el seccionamiento óptico (resolución axial). Por lo tanto, la microscopía confocal se usa comúnmente cuando la estructura 3D es importante.

Una subclase de microscopios confocales son los microscopios de disco giratorio , que pueden escanear varios puntos simultáneamente en la muestra. Un disco correspondiente con orificios rechaza la luz desenfocada. El detector de luz en un microscopio de disco giratorio es una cámara digital, normalmente EM-CCD o sCMOS .

Microscopía de dos fotones

Un microscopio de dos fotones también es un microscopio de escaneo láser, pero en lugar de luz láser UV, azul o verde, se utiliza un láser infrarrojo pulsado para la excitación. Solo en el pequeño foco del láser la intensidad es lo suficientemente alta como para generar fluorescencia por excitación de dos fotones , lo que significa que no se genera fluorescencia desenfocada y no es necesario un orificio para limpiar la imagen. [19] Esto permite obtener imágenes en profundidad en tejido disperso, donde un microscopio confocal no podría recolectar fotones de manera eficiente. [20] Los microscopios de dos fotones con detección de campo amplio se utilizan con frecuencia para imágenes funcionales, por ejemplo, imágenes de calcio , en tejido cerebral. [21] Varias empresas los comercializan como microscopios multifotónicos , aunque las ganancias de usar excitación de 3 fotones en lugar de 2 fotones son marginales.

Microscopía de iluminación de un solo plano y microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Utilizando un plano de luz formado al enfocar la luz a través de una lente cilíndrica en un ángulo estrecho o al escanear una línea de luz en un plano perpendicular al eje del objetivo, se pueden tomar secciones ópticas de alta resolución. [22] [23] [24] La iluminación de un solo plano, o iluminación de lámina de luz, también se logra utilizando técnicas de modelado de haz que incorporan expansores de haz de múltiples prismas . [25] [26] Las imágenes son capturadas por CCD. Estas variantes permiten una captura de imágenes muy rápida y con una alta relación señal-ruido.

Microscopía multifotónica de campo amplio

La microscopía multifotónica de campo amplio [27] [28] [29] [30] se refiere a una técnica de obtención de imágenes ópticas no lineales en la que se ilumina y se obtiene una imagen de un área grande del objeto sin necesidad de escanear. Se requieren altas intensidades para inducir procesos ópticos no lineales como la fluorescencia de dos fotones o la generación de segundos armónicos . En los microscopios multifotónicos de barrido, las altas intensidades se logran enfocando estrechamente la luz y la imagen se obtiene mediante el escaneo del haz. En la microscopía multifotónica de campo amplio, las altas intensidades se logran mejor utilizando una fuente de láser pulsado ópticamente amplificada para lograr un campo de visión grande (~100 μm). [27] [28] [29] La imagen en este caso se obtiene como un solo cuadro con una cámara CCD sin necesidad de escanear, lo que hace que la técnica sea particularmente útil para visualizar procesos dinámicos simultáneamente en todo el objeto de interés. Con la microscopía multifotónica de campo amplio, la velocidad de cuadros se puede aumentar hasta 1000 veces en comparación con la microscopía de barrido multifotónico . [28] Sin embargo, en el tejido disperso, la calidad de la imagen se degrada rápidamente a medida que aumenta la profundidad.

Desconvolución

La microscopía de fluorescencia es una técnica potente para mostrar estructuras marcadas específicamente en un entorno complejo y proporcionar información tridimensional de las estructuras biológicas. Sin embargo, esta información se ve borrosa por el hecho de que, al ser iluminadas, todas las estructuras marcadas con fluorescencia emiten luz, independientemente de si están enfocadas o no. Por lo tanto, la imagen de una determinada estructura siempre se ve borrosa por la contribución de la luz de las estructuras que están fuera de foco. Este fenómeno produce una pérdida de contraste, especialmente cuando se utilizan objetivos con un alto poder de resolución, normalmente objetivos de inmersión en aceite con una gran apertura numérica.

Función de dispersión de puntos modelada matemáticamente de un sistema de imágenes láser pulsado THz. [31]

Sin embargo, la borrosidad no se debe a procesos aleatorios, como la dispersión de la luz, sino que puede definirse bien por las propiedades ópticas de la formación de la imagen en el sistema de obtención de imágenes del microscopio. Si se considera una pequeña fuente de luz fluorescente (esencialmente un punto brillante), la luz que proviene de este punto se dispersa más lejos de nuestra perspectiva a medida que el punto se desenfoca más. En condiciones ideales, esto produce una forma de "reloj de arena" de esta fuente puntual en la tercera dimensión (axial). Esta forma se denomina función de dispersión de puntos (PSF) del sistema de obtención de imágenes del microscopio. Dado que cualquier imagen de fluorescencia se compone de una gran cantidad de estas pequeñas fuentes de luz fluorescente, se dice que la imagen está "convolucionada por la función de dispersión de puntos". La PSF modelada matemáticamente de un sistema de obtención de imágenes por pulsos láser de terahercios se muestra a la derecha.

La salida de un sistema de imágenes se puede describir mediante la ecuación:

Donde n es el ruido aditivo. [32] Conocer esta función de dispersión de puntos [33] significa que es posible revertir este proceso hasta cierto punto mediante métodos informáticos conocidos comúnmente como microscopía de deconvolución . [34] Hay varios algoritmos disponibles para la deconvolución 2D o 3D. Se pueden clasificar aproximadamente en métodos restaurativos y no restauradores . Si bien los métodos no restauradores pueden mejorar el contraste eliminando la luz desenfocada de los planos focales, solo los métodos restauradores pueden reasignar la luz a su lugar de origen adecuado. Procesar imágenes fluorescentes de esta manera puede ser una ventaja sobre la adquisición directa de imágenes sin luz desenfocada, como imágenes de microscopía confocal , porque las señales de luz que de otro modo se eliminarían se convierten en información útil. Para la deconvolución 3D, normalmente se proporciona una serie de imágenes tomadas de diferentes planos focales (llamadas pila Z) más el conocimiento de la PSF, que se puede derivar experimental o teóricamente al conocer todos los parámetros contribuyentes del microscopio.

Técnicas de subdifracción

Ejemplo de microscopía de superresolución. Imagen de Her3 y Her2 , dianas del fármaco contra el cáncer de mama Trastuzumab , dentro de una célula cancerosa.

En los últimos tiempos se han desarrollado multitud de técnicas de microscopía de superresolución que evitan el límite de difracción .

Esto se logra principalmente al obtener imágenes de una muestra suficientemente estática varias veces y modificar la luz de excitación u observar cambios estocásticos en la imagen. Se utilizan los métodos de deconvolución descritos en la sección anterior, que eliminan el desenfoque inducido por la PSF y asignan un origen de luz matemáticamente "correcto", aunque con una comprensión ligeramente diferente de lo que significa el valor de un píxel. Suponiendo que la mayoría de las veces , un solo fluoróforo contribuye a una sola mancha en una sola imagen tomada, las manchas en las imágenes se pueden reemplazar con su posición calculada, lo que mejora enormemente la resolución hasta quedar muy por debajo del límite de difracción.

Para hacer realidad tal suposición, el conocimiento y el control químico de la fotofísica de los fluoróforos son la base de estas técnicas, mediante las cuales se obtienen resoluciones de ~20 nanómetros. [35] [36]

Microscopía amplificada codificada en el tiempo en serie

La microscopía amplificada codificada en tiempo serial (STEAM) es un método de obtención de imágenes que proporciona una velocidad de obturación y una frecuencia de cuadros ultrarrápidas, mediante el uso de la amplificación óptica de imágenes para evitar el equilibrio fundamental entre sensibilidad y velocidad, y un fotodetector de un solo píxel para eliminar la necesidad de una matriz de detectores y las limitaciones de tiempo de lectura [37] . El método es al menos 1000 veces más rápido que las cámaras CCD y CMOS de última generación . En consecuencia, es potencialmente útil para aplicaciones científicas, industriales y biomédicas que requieren altas tasas de adquisición de imágenes, incluido el diagnóstico y la evaluación en tiempo real de ondas de choque, microfluídica , MEMS y cirugía láser . [38]

Extensiones

La mayoría de los instrumentos modernos ofrecen soluciones sencillas para la microfotografía y la grabación electrónica de imágenes. Sin embargo, estas capacidades no siempre están disponibles y los microscopistas más experimentados pueden preferir una imagen dibujada a mano en lugar de una fotografía. Esto se debe a que un microscopista con conocimientos del tema puede convertir con precisión una imagen tridimensional en un dibujo bidimensional preciso. Sin embargo, en una fotografía u otro sistema de captura de imágenes, solo un plano delgado está siempre bien enfocado. [ cita requerida ]

La creación de micrografías precisas requiere una técnica microscópica que utilice un ocular monocular. Es esencial que ambos ojos estén abiertos y que el ojo que no observa a través del microscopio se concentre en una hoja de papel que se encuentra en la mesa de trabajo junto al microscopio. Con práctica, y sin mover la cabeza ni los ojos, es posible trazar con precisión las formas observadas al "ver" simultáneamente la punta del lápiz en la imagen microscópica. [ cita requerida ]

Siempre es menos cansador observar con el microscopio enfocado de manera que la imagen se vea al infinito y con ambos ojos abiertos en todo momento. [ cita requerida ]

Otras mejoras

Microespectroscopia:espectroscopia con microscopio

radiografía

Como la resolución depende de la longitud de onda de la luz, la microscopía electrónica se desarrolló a partir de la década de 1930 y utiliza haces de electrones en lugar de luz. Debido a que la longitud de onda del haz de electrones es mucho menor, la resolución es mucho mayor.

Aunque es menos común, la microscopía de rayos X también se ha desarrollado desde finales de la década de 1940. La resolución de la microscopía de rayos X se encuentra entre la de la microscopía óptica y la de la microscopía electrónica.

Microscopía electrónica

Hasta la invención de la microscopía de subdifracción, la longitud de onda de la luz limitaba la resolución de la microscopía tradicional a unos 0,2 micrómetros. Para conseguir una mayor resolución, en los microscopios electrónicos se utiliza un haz de electrones con una longitud de onda mucho menor.

Los microscopios electrónicos equipados para espectroscopia de rayos X pueden proporcionar análisis elemental cualitativo y cuantitativo. Este tipo de microscopio electrónico, también conocido como microscopio electrónico analítico, puede ser una herramienta muy poderosa para la investigación de nanomateriales . [39]

Microscopía de sonda de barrido

Se trata de una técnica de subdifracción. Algunos ejemplos de microscopios de sonda de barrido son el microscopio de fuerza atómica (AFM), el microscopio de efecto túnel de barrido , el microscopio de fuerza fotónica y el microscopio de seguimiento de recurrencia . Todos estos métodos utilizan el contacto físico de una punta de sonda sólida para escanear la superficie de un objeto, que se supone que es casi plana.

Fuerza ultrasónica

La microscopía de fuerza ultrasónica (UFM) se ha desarrollado para mejorar los detalles y el contraste de la imagen en áreas de interés "planas" donde las imágenes AFM tienen un contraste limitado. La combinación de AFM-UFM permite generar una imagen microscópica acústica de campo cercano. La punta AFM se utiliza para detectar las ondas ultrasónicas y supera la limitación de longitud de onda que se produce en la microscopía acústica. Al utilizar los cambios elásticos debajo de la punta AFM, se puede generar una imagen con mucho más detalle que la topografía AFM.

La microscopía de fuerza ultrasónica permite el mapeo local de la elasticidad en la microscopía de fuerza atómica mediante la aplicación de vibración ultrasónica al voladizo o a la muestra. Para analizar los resultados de la microscopía de fuerza ultrasónica de manera cuantitativa, se realiza una medición de la curva fuerza-distancia con vibración ultrasónica aplicada a la base del voladizo y los resultados se comparan con un modelo de la dinámica del voladizo y la interacción punta-muestra basado en la técnica de diferencias finitas.

Microscopía ultravioleta

Los microscopios ultravioleta tienen dos propósitos principales. El primero es utilizar la longitud de onda más corta de la energía electromagnética ultravioleta para mejorar la resolución de la imagen más allá del límite de difracción de los microscopios ópticos estándar. Esta técnica se utiliza para la inspección no destructiva de dispositivos con características muy pequeñas, como las que se encuentran en los semiconductores modernos. La segunda aplicación de los microscopios ultravioleta es la mejora del contraste, donde se mejora la respuesta de las muestras individuales, en relación con su entorno, debido a la interacción de la luz con las moléculas dentro de la propia muestra. Un ejemplo es el crecimiento de cristales de proteínas . Los cristales de proteínas se forman en soluciones salinas. Como los cristales de sal y proteína se forman en el proceso de crecimiento, y ambos son comúnmente transparentes para el ojo humano, no se pueden diferenciar con un microscopio óptico estándar. Como el triptófano de la proteína absorbe la luz a 280 nm, la obtención de imágenes con un microscopio ultravioleta con filtros de paso de banda de 280 nm hace que sea sencillo diferenciar entre los dos tipos de cristales. Los cristales de proteína aparecen oscuros, mientras que los cristales de sal son transparentes.

Microscopía infrarroja

El término microscopía infrarroja se refiere a la microscopía realizada en longitudes de onda infrarrojas . En la configuración típica del instrumento, un espectrómetro infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) se combina con un microscopio óptico y un detector infrarrojo . El detector infrarrojo puede ser un detector de punto único, una matriz lineal o una matriz de plano focal 2D. FTIR proporciona la capacidad de realizar análisis químico a través de espectroscopia infrarroja y el microscopio y el detector puntual o de matriz permiten que este análisis químico se resuelva espacialmente, es decir, se realice en diferentes regiones de la muestra. Como tal, la técnica también se denomina microespectroscopia infrarroja [40] [41] Una arquitectura alternativa llamada imágenes infrarrojas directas por láser (LDIR) implica la combinación de una fuente de luz infrarroja sintonizable y un detector de punto único en un objetivo volante. Esta técnica se utiliza con frecuencia para imágenes químicas infrarrojas , donde el contraste de la imagen está determinado por la respuesta de regiones de muestra individuales a longitudes de onda IR particulares seleccionadas por el usuario, generalmente bandas de absorción IR específicas y resonancias moleculares asociadas . Una limitación clave de la microespectroscopia infrarroja convencional es que la resolución espacial está limitada por difracción . En concreto, la resolución espacial está limitada a una cifra relacionada con la longitud de onda de la luz. En el caso de los microscopios IR prácticos, la resolución espacial está limitada a entre 1 y 3 veces la longitud de onda, según la técnica y el instrumento específicos utilizados. Para las longitudes de onda del infrarrojo medio, esto establece un límite práctico de resolución espacial de entre 3 y 30 μm.

También existen versiones IR de la microscopía de subdifracción. [40] [41] Estas incluyen el microscopio óptico de barrido de campo cercano IR (NSOM) , [42] la microespectroscopia fototérmica y la espectroscopia infrarroja basada en microscopio de fuerza atómica (AFM-IR) , así como la microscopía óptica de barrido de campo cercano de tipo dispersión (s-SNOM) [43] y el nano-FTIR que proporcionan una resolución espacial a nanoescala en longitudes de onda IR.

Microscopía holográfica digital

Células humanas obtenidas mediante microscopía de cambio de fase DHM (izquierda) y de contraste de fase (derecha)

En la microscopía holográfica digital (DHM), los frentes de onda que interfieren con una fuente de luz coherente (monocromática) se registran en un sensor. La imagen se reconstruye digitalmente mediante un ordenador a partir del holograma registrado . Además de la imagen de campo claro habitual, se crea una imagen de desplazamiento de fase .

El DHM puede funcionar tanto en modo de reflexión como de transmisión. En el modo de reflexión, la imagen de desplazamiento de fase proporciona una medición de la distancia relativa y, por lo tanto, representa un mapa topográfico de la superficie reflectante. En el modo de transmisión, la imagen de desplazamiento de fase proporciona una medición cuantitativa sin etiquetas del espesor óptico de la muestra. Las imágenes de desplazamiento de fase de células biológicas son muy similares a las imágenes de células teñidas y se han analizado con éxito mediante software de análisis de alto contenido .

Una característica única de DHM es la capacidad de ajustar el enfoque después de que se graba la imagen, ya que todos los planos de enfoque se graban simultáneamente por el holograma. Esta característica permite obtener imágenes de partículas en movimiento en un volumen o escanear rápidamente una superficie. Otra característica atractiva es la capacidad de DHM de utilizar ópticas de bajo costo corrigiendo las aberraciones ópticas mediante software.

Patología digital (microscopía virtual)

La patología digital es un entorno de información basado en imágenes que se habilita mediante tecnología informática y permite gestionar la información generada a partir de un portaobjetos digital. La patología digital se habilita en parte mediante la microscopía virtual , que es la práctica de convertir portaobjetos de vidrio en portaobjetos digitales que se pueden ver, administrar y analizar.

Microscopía láser

La microscopía láser es un campo en rápido crecimiento que utiliza fuentes de iluminación láser en diversas formas de microscopía. [44] Por ejemplo, la microscopía láser enfocada en aplicaciones biológicas utiliza láseres de pulso ultracorto , en una serie de técnicas etiquetadas como microscopía no lineal, microscopía de saturación y microscopía de excitación de dos fotones . [45]

Durante varios años se han estado desarrollando láseres de rayos X de laboratorio de pulso corto y alta intensidad . Cuando esta tecnología se haga realidad, será posible obtener imágenes tridimensionales ampliadas de estructuras biológicas elementales en estado vivo en un instante definido con precisión. Para lograr un contraste óptimo entre el agua y la proteína y para lograr la mejor sensibilidad y resolución, el láser debe ajustarse cerca de la línea de nitrógeno, a unos 0,3 nanómetros. La resolución estará limitada principalmente por la expansión hidrodinámica que se produce mientras se registra la cantidad necesaria de fotones. [46] De este modo, mientras la muestra se destruye por la exposición, se puede capturar su configuración antes de que explote. [47] [48] [49] [50] [51] [52] [ citas excesivas ]

Los científicos han estado trabajando en diseños prácticos y prototipos de microscopios holográficos de rayos X, a pesar del prolongado desarrollo del láser apropiado. [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [ citas excesivas ]

Microscopía fotoacústica

Micrografía fotoacústica de glóbulos rojos humanos.

Una técnica de microscopía que se basa en el efecto fotoacústico , [61] es decir, la generación de (ultra)sonidos causados ​​por la absorción de luz. Un haz láser enfocado y de intensidad modulada se escanea en forma de trama sobre una muestra. El (ultra)sonido generado se detecta mediante un transductor de ultrasonidos. Comúnmente se emplean transductores de ultrasonidos piezoeléctricos. [62]

El contraste de la imagen está relacionado con el coeficiente de absorción de la muestra . Esto contrasta con la microscopía de campo claro u oscuro, donde el contraste de la imagen se debe a la transmitancia o dispersión. En principio, el contraste de la microscopía de fluorescencia también es proporcional a la absorción de la muestra. Sin embargo, en la microscopía de fluorescencia, el rendimiento cuántico de fluorescencia debe ser distinto de cero para que se pueda detectar una señal. Sin embargo, en la microscopía fotoacústica, cada sustancia absorbente proporciona una señal fotoacústica que es proporcional a

Aquí se muestra el coeficiente de Grüneisen, la energía del fotón del láser y la energía de la banda prohibida de la muestra. Por lo tanto, la microscopía fotoacústica parece ser una técnica complementaria adecuada a la microscopía de fluorescencia, ya que un alto rendimiento cuántico de fluorescencia conduce a altas señales de fluorescencia y un bajo rendimiento cuántico de fluorescencia conduce a altas señales fotoacústicas.

Si se descuidan los efectos no lineales, la resolución lateral dx está limitada por el límite de difracción de Abbe :

donde es la longitud de onda del láser de excitación y NA es la apertura numérica de la lente del objetivo. El límite de difracción de Abbe se cumple si el frente de onda entrante es paralelo. Sin embargo, en realidad, el perfil del haz láser es gaussiano. Por lo tanto, para calcular la resolución alcanzable, se deben utilizar fórmulas para haces gaussianos truncados. [63]

Microscopía amateur

La microscopía amateur es la investigación y observación de especímenes biológicos y no biológicos con fines recreativos. Los coleccionistas de minerales , insectos , conchas marinas y plantas pueden utilizar microscopios como herramientas para descubrir características que les ayuden a clasificar los elementos que han recolectado. Otros aficionados pueden estar interesados ​​en observar la vida que se encuentra en el agua de los estanques y en otras muestras. Los microscopios también pueden resultar útiles para la evaluación de la calidad del agua para las personas que tienen un acuario en casa. La documentación fotográfica y el dibujo de las imágenes microscópicas son placeres adicionales. Existen concursos de arte de fotomicrografía . Los participantes de este pasatiempo pueden utilizar portaobjetos microscópicos preparados comercialmente o preparar sus propios portaobjetos.

Aunque la microscopía es una herramienta fundamental para documentar especímenes biológicos, a menudo no es suficiente para justificar la descripción de una nueva especie basándose únicamente en investigaciones microscópicas. A menudo, se necesitan pruebas genéticas y bioquímicas para confirmar el descubrimiento de una nueva especie. Un laboratorio y el acceso a la literatura académica son una necesidad. Sin embargo, existe una ventaja que los aficionados tienen sobre los profesionales: tiempo para explorar su entorno. A menudo, los aficionados avanzados se asocian con profesionales para validar sus hallazgos y posiblemente describir nuevas especies.

A finales del siglo XIX, la microscopía amateur se convirtió en un pasatiempo popular en Estados Unidos y Europa. Varios "aficionados profesionales" recibían dinero de filántropos para sus viajes de muestreo y exploraciones microscópicas, para entretenerse los domingos por la tarde (por ejemplo, el especialista en diatomeas A. Grunow, que recibía dinero de (entre otros) un industrial belga). El profesor John Phin publicó "Consejos prácticos para la selección y el uso del microscopio (segunda edición, 1878)" y también fue el editor del "American Journal of Microscopy".

Ejemplos de imágenes de microscopía amateur:

Aplicación en la ciencia forense

La microscopía tiene aplicaciones en las ciencias forenses. [64] El microscopio puede detectar, resolver y obtener imágenes de los elementos de evidencia más pequeños, a menudo sin ninguna alteración o destrucción. El microscopio se utiliza para identificar y comparar fibras, pelos, tierra y polvo, etc.

En el caso de marcas de tinta, manchas de sangre o balas, no se requiere ningún tratamiento de la muestra y la evidencia se muestra directamente mediante el examen microscópico. En el caso de rastros de materia particular, la preparación de la muestra debe realizarse antes de que se realice el examen microscópico. [ Aclaración necesaria ]

Los microscopios ópticos son los más utilizados en la ciencia forense, ya que utilizan fotones para formar imágenes. Los microscopios más aplicables para examinar muestras forenses son los siguientes: [65]

1. El microscopio compuesto

2. El microscopio de comparación

3. El microscopio estereoscópico

4. El microscopio polarizador

5. El micro espectrofotómetro

Esta diversidad de tipos de microscopios en aplicaciones forenses proviene principalmente de sus rangos de aumento, que son (1- 1200X), (50-30.000X) y (500- 250.000X) para la microscopía óptica, SEM y TEM respectivamente. [65]

Véase también

Referencias

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Lectura adicional

Enlaces externos

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General

Técnicas