En neurociencia , la inactivación por bola y cadena es un modelo para explicar el mecanismo de inactivación rápida de los canales iónicos dependientes de voltaje . El proceso también se denomina inactivación por tapa abisagrada o inactivación de tipo N. Un canal iónico dependiente de voltaje puede estar en tres estados: abierto, cerrado o inactivado. El estado inactivado se logra principalmente a través de una inactivación rápida, por la cual un canal pasa rápidamente de un estado abierto a un estado inactivado. El modelo propone que el estado inactivado, que es estable y no conductor, es causado por el bloqueo físico del poro. El bloqueo es causado por una "bola" de aminoácidos conectados a la proteína principal por una cadena de residuos en el lado citoplasmático de la membrana. La bola ingresa al canal abierto y se une al vestíbulo interno hidrofóbico dentro del canal. Este bloqueo causa la inactivación del canal al detener el flujo de iones . [1] [2] Este fenómeno se ha estudiado principalmente en los canales de potasio y los canales de sodio . [3]
La evidencia inicial de una inactivación de bola y cadena llegó en 1977 con el trabajo de Clay Armstrong y Francisco Bezanilla . [4] La sugerencia de una base física para la no conductancia provino de experimentos en axones gigantes de calamar , que mostraban que el tratamiento interno con pronasa interrumpía el fenómeno de inactivación. Esto sugirió un mecanismo físico y atado para la inactivación, ya que se infirió que la pronasa degradaba el bloqueador del canal y abolía el proceso de inactivación. Estos experimentos también mostraron que la inactivación solo puede ocurrir después de la apertura del canal. Esto se hizo hiperpolarizando la membrana, lo que provocó que el canal se abriera y se observó un retraso en la inactivación. No se observó inactivación cuando la membrana se despolarizó (cerró). Se descubrió que la introducción de tetraetilamonio (TEA) en el lado intracelular del canal imitaba la inactivación en canales no inactivadores. [5] El bloqueo del canal por TEA es mutuamente excluyente con el bloqueo mediado por péptidos, lo que sugiere que TEA compite por un sitio de unión de inactivación . [6]
Los experimentos de mutagénesis han identificado una cadena intracelular de aminoácidos como candidatos principales para el bloqueador de poros. [5] La secuencia precisa de aminoácidos que compone la bola bloqueadora de canales en los canales de potasio se identificó mediante la creación de un péptido sintético . El péptido se construyó basándose en la secuencia de un residuo de 20 aminoácidos de la proteína Shaker ShB de Drosophila melanogaster y se aplicó en el lado intracelular de un canal no inactivador en ovocitos de Xenopus . El péptido restauró la inactivación del canal, dando más apoyo al modelo de bola y cadena. En las proteínas β 2 , los primeros tres residuos después de la metionina inicial se han identificado como esenciales para la inactivación. Los residuos iniciales tienen un motivo de secuencia de fenilalanina , isoleucina y triptófano sin el cual no ocurre la inactivación. Modificar los residuos posteriores altera la velocidad y la eficacia de la inactivación sin abolirla. [7]
Más recientemente, los estudios de resonancia magnética nuclear en canales BK de ovocitos de Xenopus han arrojado más luz sobre las propiedades estructurales del dominio de bola y cadena. [8] La introducción de la subunidad β de KCNMB2 en el lado citoplasmático de un canal no inactivador restauró la inactivación, de acuerdo con el comportamiento esperado de una proteína de tipo bola y cadena. El análisis de RMN mostró que el dominio de bola está compuesto por los residuos 1-17 y la región de cadena por los residuos 20-45. Los tres aminoácidos en el medio constituyen una región de enlace flexible entre las dos regiones funcionales. La bola está en el extremo N de la subunidad β y consta de una parte desordenada (residuos 1-10) y un motivo de hélice de bucle formado por un bloque de aminoácidos que abarca desde la serina en la posición 11 hasta el aspartato en la posición 16. La estructura del dominio de cadena es una estructura de hélice alfa de 4 vueltas .
Los dominios de bola y cadena se encuentran en el lado citoplasmático del canal. Los estudios estructurales más precisos se han llevado a cabo en canales de potasio Shaker , en los que se han identificado los residuos precisos implicados en el proceso. Los primeros 19 aminoácidos del extremo N constituyen el dominio de bola. Este está formado por 11 aminoácidos hidrófobos , 8 hidrófilos y 4 con carga positiva. [9] Los siguientes 60 aminoácidos constituyen el dominio de cadena. Modificar los aminoácidos de la bola conservando sus propiedades químicas no altera el mecanismo de inactivación. Esto sugiere que la bola ocluye el canal uniéndose electrostáticamente en lugar de covalentemente . [10] Los estudios estructurales han demostrado que el poro interno del canal de potasio es accesible solo a través de hendiduras laterales entre los dominios citoplasmáticos de las cuatro subunidades α , en lugar de desde una ruta central como se pensaba anteriormente. [11] El dominio de bola ingresa al canal a través de las ranuras laterales y se adhiere a un sitio de unión en lo profundo de la cavidad central . Este proceso implica un cambio conformacional , que permite que el bloqueador de bola y cadena se alargue y alcance el centro interno del canal. [12]
Se cree que una región con carga positiva entre los dominios III y IV de los canales de sodio actúa de manera similar. [9] La región esencial para la inactivación en los canales de sodio es una secuencia de cuatro aminoácidos compuesta por isoleucina , fenilalanina , metionina y treonina (IFMT). [13] La T y la F interactúan directamente con el sitio de acoplamiento en el poro del canal. [14] Cuando los canales de sodio dependientes de voltaje se abren , el segmento S4 se mueve hacia afuera del canal y hacia el lado extracelular. Esto expone residuos hidrófobos en los segmentos S4 y S5 que interactúan con la bola de inactivación. La fenilalanina de la bola interactúa con la alanina en los segmentos S4-S5 del dominio III y la asparagina en los segmentos S4-S5 del dominio IV. [15] Esto explica por qué la inactivación solo puede ocurrir una vez que el canal está abierto.
También hay hendiduras laterales en los canales de sodio, [16] lo que sugiere que la ruta de acceso al dominio de bola puede ser similar.
Existe una distinción entre la inactivación directa y la inactivación en dos pasos. La inactivación directa, que ocurre en los canales de potasio Shaker , resulta del bloqueo directo del canal por la proteína ball, mientras que la inactivación en dos pasos, que se cree que ocurre en los canales BK , requiere un paso de unión intermedio. [17]
El mecanismo de inactivación por bola y cadena también es distinto del bloqueo dependiente de voltaje por moléculas intracelulares o regiones peptídicas de subunidades beta4 en los canales de sodio . [18] Cuando estos bloqueos contribuyen a la inactivación del canal de sodio después de la apertura del canal, la repolarización de la membrana revierte el bloqueo y puede causar una corriente resurgiente: un flujo de iones entre el desbloqueo y el cierre del canal. [19]
Los canales de potasio tienen una característica adicional en el extremo N que hace que los canales no puedan inactivarse. El dominio de prevención de inactivación de tipo N (NIP) contrarresta el efecto de la bola de péptidos. Los canales que contienen el dominio NIP se comportan como canales no inactivadores mutados, ya que no tienen actividad de inactivación. [20] Se cree que el efecto es estequiométrico , ya que la introducción gradual de bolas sintéticas no unidas al citoplasma finalmente restaura la inactivación. [21]
La interacción entre la apertura y la inactivación controla el patrón de activación de una neurona al cambiar la velocidad y la cantidad de flujo de iones a través de los canales. Los canales iónicos controlados por voltaje se abren tras la despolarización de la membrana celular . Esto crea una corriente causada por el flujo de iones a través del canal. Poco después de la apertura, el canal queda bloqueado por la bola peptídica. La subunidad β1 ayuda a la recuperación de la inactivación, [22] mientras que la β2 acelera la inactivación. [ 23] Las subunidades β también pueden interferir con los dominios de bola y cadena al bloquear su entrada al canal. Esto conduce a corrientes persistentes, causadas por la afluencia continua de iones. La subunidad β3 puede aumentar la corriente persistente en ciertos canales de sodio. [13]
Las diferencias entre las corrientes persistentes y las corrientes resurgentes se han relacionado con ciertos trastornos neurológicos y neuromusculares humanos. En la epilepsia , las mutaciones en los genes de los canales de sodio retrasan la inactivación. Esto hace que el canal permanezca abierto durante más tiempo y, por lo tanto, la activación neuronal sea más duradera. [24] En la epilepsia se observan niveles más altos de corriente persistente. Esta estimulación neuronal constante y de bajo nivel se ha relacionado con las convulsiones típicas de este trastorno. [25]
Las anomalías de inactivación también se han relacionado con el síndrome de Brugada . Las mutaciones en los genes que codifican la subunidad α de los canales de sodio cardíacos afectan la inactivación. Estas aumentan la corriente persistente al interferir con la inactivación, aunque diferentes mutaciones tienen efectos opuestos en la velocidad de inactivación. [26]
Las mutaciones en la subunidad α de los músculos esqueléticos también se asocian con la miotonía . La hiperexcitación muscular característica de la miotonía se debe principalmente a la presencia de canales de sodio que no se inactivan, lo que provoca altos niveles de corriente persistente en los músculos. [27]