La fenilalanina hidroxilasa ( PAH ) ( EC 1.14.16.1) es una enzima que cataliza la hidroxilación de la cadena lateral aromática de la fenilalanina para generar tirosina . La PAH es uno de los tres miembros de las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos dependientes de biopterina , una clase de monooxigenasa que utiliza tetrahidrobiopterina (BH 4 , un cofactor de pteridina ) y un hierro no hemo para la catálisis. Durante la reacción, el oxígeno molecular se escinde heterolíticamente con la incorporación secuencial de un átomo de oxígeno en BH 4 y el sustrato de fenilalanina. [5] [6] En los seres humanos, las mutaciones en su gen codificante, PAH , pueden provocar el trastorno metabólico fenilcetonuria .
Se cree que la reacción se desarrolla a través de los siguientes pasos:
Formación y escisión del puente hierro-peroxipterina. Aunque la evidencia apoya firmemente a Fe(IV)=O como el intermediario hidroxilante, [8] los detalles mecanísticos subyacentes a la formación del puente Fe(II)-OO-BH 4 antes de la escisión heterolítica siguen siendo controvertidos. Se han propuesto dos vías basadas en modelos que difieren en la proximidad del hierro al cofactor pterina y el número de moléculas de agua que se supone que están coordinadas con el hierro durante la catálisis. Según un modelo, inicialmente se forma y se estabiliza un complejo de hierro y dioxígeno como un híbrido de resonancia de Fe 2+ O 2 y Fe 3+ O 2 − . Luego, el O 2 activado ataca al BH 4 , formando un estado de transición caracterizado por la separación de carga entre el anillo de pterina deficiente en electrones y la especie de dioxígeno rica en electrones. [9] Posteriormente se forma el puente Fe(II)-OO-BH 4 . Por otra parte, la formación de este puente se ha modelado asumiendo que el BH4 se encuentra en la primera capa de coordinación del hierro y que el hierro no está coordinado con ninguna molécula de agua. Este modelo predice un mecanismo diferente que involucra un radical pterina y un superóxido como intermediarios críticos. [10] Una vez formado, el puente Fe(II)-OO-BH4 se rompe a través de la escisión heterolítica del enlace OO a Fe(IV)=O y 4a-hidroxitetrahidrobiopterina; por lo tanto, el oxígeno molecular es la fuente de ambos átomos de oxígeno utilizados para hidroxilar el anillo de pterina y la fenilalanina.
Hidroxilación de la fenilalanina por intermedio de oxoferilo. Debido a que el mecanismo implica un intermedio hidroxilante Fe(IV)=O (en oposición a una peroxipterina), la oxidación del cofactor BH 4 y la hidroxilación de la fenilalanina pueden desacoplarse, lo que resulta en un consumo improductivo de BH 4 y la formación de H 2 O 2 . [7] Sin embargo, cuando es productiva, el intermedio Fe(IV)=O se agrega a la fenilalanina en una reacción de sustitución aromática electrofílica que reduce el hierro del estado ferrilo al ferroso. [7] Aunque inicialmente se propuso un óxido de areno o un intermedio radical, los análisis de las hidroxilasas de triptófano y tirosina relacionadas han sugerido que la reacción procede en cambio a través de un intermedio catiónico que requiere que Fe(IV)=O se coordine con un ligando de agua en lugar de un grupo hidroxo. [7] [11] Este intermedio catiónico posteriormente sufre un cambio de 1,2-hidruro NIH, produciendo un intermedio de dienona que luego se tautomeriza para formar el producto de tirosina. [12] El cofactor pterina se regenera por hidratación del producto carbinolamina de PAH a dihidrobiopterina quinonoide (qBH 2 ), que luego se reduce a BH 4 . [13]
Se propone que la PAH utilice el modelo de morfeína de regulación alostérica . [14] [15]
Los HAP de los mamíferos se encuentran en un equilibrio que consiste en tetrámeros de dos arquitecturas distintas, con una o más formas diméricas como parte del equilibrio. Este comportamiento es consistente con un mecanismo alostérico disociativo. [15]
Muchos estudios sugieren que el HAP de los mamíferos muestra un comportamiento comparable a la porfobilinógeno sintasa (PBGS), en la que se informa que una variedad de factores como el pH y la unión del ligando afectan la actividad enzimática y la estabilidad de las proteínas. [15]
El monómero PAH (51,9 kDa) consta de tres dominios distintos: un dominio regulador N-terminal (residuos 1-117) que contiene un subdominio ACT de unión a Phe, el dominio catalítico (residuos 118-427) y un dominio C-terminal (residuos 428-453) responsable de la oligomerización de monómeros idénticos. Se ha realizado un análisis cristalográfico exhaustivo, especialmente en el dominio catalítico coordinado por pterina y hierro para examinar el sitio activo. También se ha determinado la estructura del dominio regulador N-terminal y, junto con la estructura resuelta del dominio de tetramerización C-terminal de la tirosina hidroxilasa homóloga, se propuso un modelo estructural de PAH tetramérico. [13] Utilizando cristalografía de rayos X, se determinó experimentalmente la estructura de PAH de rata de longitud completa y se mostró la forma autoinhibida o en estado de reposo de la enzima. [16] La forma en estado de reposo (RS-PAH) es arquitectónicamente distinta de la forma activada (A-PAH). [17] Actualmente no se dispone de una estructura completa de A-PAH, pero se ha determinado la interfaz ACT-ACT estabilizada con Phe que es característica de A-PAH y se ha propuesto un modelo estructural de A-PAH basado en el análisis SAXS. [18] [19]
Las estructuras cristalinas resueltas del dominio catalítico indican que el sitio activo consiste en un bolsillo abierto y espacioso revestido principalmente por residuos hidrófobos, aunque también están presentes tres residuos de ácido glutámico, dos histidinas y una tirosina que se unen al hierro. [13] Existe evidencia contradictoria sobre el estado de coordinación del átomo ferroso y su proximidad a BH4 dentro del sitio activo. Según el análisis cristalográfico, Fe(II) está coordinado por agua, His285, His290 y Glu330 (una disposición de tríada facial 2-his-1-carboxilato) con geometría octaédrica. [20] La inclusión de un análogo de Phe en la estructura cristalina cambia tanto el hierro de un estado de coordinación seis a cinco que involucra una sola molécula de agua como la coordinación bidentada a Glu330 y abre un sitio para que el oxígeno se una. BH4 se desplaza concomitantemente hacia el átomo de hierro, aunque el cofactor pterina permanece en la segunda esfera de coordinación. [21] Por otro lado, un modelo competitivo basado en análisis de RMN y modelado molecular sugiere que todas las moléculas de agua coordinadas son expulsadas del sitio activo durante el ciclo catalítico mientras que BH4 se coordina directamente con el hierro. [22] Como se discutió anteriormente, resolver esta discrepancia será importante para determinar el mecanismo exacto de catálisis de PAH.
La naturaleza reguladora del dominio N-terminal (residuos 1-117) es conferida por su flexibilidad estructural. [23] El análisis de intercambios de hidrógeno/deuterio indica que la unión alostérica de Phe altera globalmente la conformación de PAH de tal manera que el sitio activo está menos ocluido a medida que la interfaz entre los dominios regulador y catalítico está cada vez más expuesta al solvente. [23] [24] [25] Esta observación es consistente con estudios cinéticos, que muestran una tasa inicialmente baja de formación de tirosina para PAH de longitud completa. Sin embargo, este tiempo de retraso no se observa para un PAH truncado que carece del dominio N-terminal o si la enzima de longitud completa se preincuba con Phe. La eliminación del dominio N-terminal también elimina el tiempo de retraso mientras aumenta la afinidad por Phe en casi el doble; no se observa diferencia en la Vmax o Km para el cofactor tetrahidrobiopterina. [26] Ser16 proporciona regulación adicional; La fosforilación de este residuo no altera la conformación de la enzima pero reduce la concentración de Phe necesaria para la activación alostérica. [25] Este dominio regulador N-terminal no se observa en los HAP bacterianos pero muestra una homología estructural considerable con el dominio regulador de la fosfoglicerato deshidrogenasa, una enzima en la vía biosintética de la serina. [25]
El PAH procariota es monomérico, mientras que el PAH eucariota existe en un equilibrio entre las formas homotetramérica y homodimérica. [7] [13] La interfaz de dimerización está compuesta de bucles relacionados con la simetría que unen monómeros idénticos, mientras que el dominio de tetramerización C-terminal superpuesto media la asociación de dímeros conformacionalmente distintos que se caracterizan por una orientación relativa diferente de los dominios catalítico y de tetramerización (Flatmark, Erlandsen). La distorsión resultante de la simetría del tetrámero es evidente en el área superficial diferencial de las interfaces de dimerización y distingue al PAH de la tirosina hidroxilasa tetraméricamente simétrica. [13] Se ha propuesto un mecanismo de intercambio de dominios para mediar la formación del tetrámero a partir de dímeros, en el que las hélices alfa C-terminales alteran mutuamente su conformación alrededor de una región de bisagra flexible de cinco residuos C-terminal para formar una estructura de bobina enrollada, desplazando el equilibrio hacia la forma tetramérica. [7] [13] [27] Aunque tanto la forma homodímera como la homotetramérica de la HAP son catalíticamente activas, ambas presentan una cinética y una regulación diferenciales. Además de una eficiencia catalítica reducida, el dímero no muestra una cooperatividad positiva hacia la L-Phe (que en altas concentraciones activa la enzima), lo que sugiere que la L-Phe regula alostéricamente la HAP al influir en la interacción dímero-dímero. [27]
La PAH es una enzima crítica en el metabolismo de la fenilalanina y cataliza el paso limitante de la velocidad en su catabolismo completo a dióxido de carbono y agua. [13] [28] La regulación del flujo a través de las vías asociadas a la fenilalanina es crítica en el metabolismo de los mamíferos, como lo demuestra la toxicidad de los altos niveles plasmáticos de este aminoácido observados en la fenilcetonuria (ver más abajo). La principal fuente de fenilalanina son las proteínas ingeridas, pero relativamente poco de este grupo se utiliza para la síntesis de proteínas. [28] En cambio, la mayoría de la fenilalanina ingerida se cataboliza a través de la PAH para formar tirosina ; la adición del grupo hidroxilo permite que el anillo de benceno se rompa en pasos catabólicos posteriores. La transaminación a fenilpiruvato , cuyos metabolitos se excretan en la orina, representa otra vía de recambio de fenilalanina, pero predomina el catabolismo a través de la PAH. [28]
En los seres humanos, esta enzima se expresa tanto en el hígado como en el riñón, y hay algunos indicios de que puede estar regulada de forma diferencial en estos tejidos. [29] La HAP es inusual entre las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos por su participación en el catabolismo; las hidroxilasas de tirosina y triptófano , por otro lado, se expresan principalmente en el sistema nervioso central y catalizan los pasos limitantes de la velocidad en la biosíntesis de neurotransmisores/hormonas. [13]
La deficiencia en la actividad de PAH debido a mutaciones en PAH causa hiperfenilalaninemia (HPA), y cuando los niveles de fenilalanina en sangre aumentan por encima de 20 veces la concentración normal, resulta en la enfermedad metabólica fenilcetonuria (PKU). [28] La PKU es tanto genotípica como fenotípicamente heterogénea: se han identificado más de 300 variantes patogénicas distintas, la mayoría de las cuales corresponden a mutaciones sin sentido que se asignan al dominio catalítico. [13] [20] Cuando una cohorte de mutantes de PAH identificados se expresaron en sistemas recombinantes, las enzimas mostraron un comportamiento cinético alterado y/o una estabilidad reducida, en consonancia con el mapeo estructural de estas mutaciones tanto a los dominios catalíticos como de tetramerización de la enzima. [13] BH4 4 se ha administrado como un tratamiento farmacológico y se ha demostrado que reduce los niveles sanguíneos de fenilalanina para un segmento de pacientes con PKU cuyos genotipos conducen a alguna actividad residual de PAH pero no tienen ningún defecto en la síntesis o regeneración de BH4 4 . Estudios de seguimiento sugieren que en el caso de ciertos mutantes de PAH, el exceso de BH4 4 actúa como una chaperona farmacológica para estabilizar las enzimas mutantes con ensamblaje de tetrámeros interrumpido y mayor sensibilidad a la escisión y agregación proteolítica. [30] Las mutaciones que se han identificado en el locus PAH están documentadas en la base de datos de conocimientos del locus de fenilalanina hidroxilasa (PAHdb, https://web.archive.org/web/20130718162051/http://www.pahdb.mcgill.ca/).
Dado que la fenilcetonuria puede causar daños irreversibles, es imperativo que las deficiencias en la fenilalanina hidroxilasa se determinen en las primeras etapas del desarrollo. Originalmente, esto se hacía utilizando un ensayo de inhibición bacteriana conocido como la prueba de Guthrie . Ahora, la PKU es parte de la detección neonatal en muchos países, y los niveles elevados de fenilalanina se identifican poco después del nacimiento mediante la medición con espectrometría de masas en tándem . Someter al individuo a una dieta baja en fenilalanina y alta en tirosina puede ayudar a prevenir cualquier daño a largo plazo en su desarrollo.
El primer intento de crear un modelo de ratón Pah -KO se informó en un artículo de investigación publicado en 2021. [31] Este ratón knockout fue creado para ser homocigoto a través de su desarrollo dentro de la cepa C57BL/6 J usando CRISPR / Cas9 . [32] El codón 7, GAG, en el gen Pah se alteró al codón de terminación TAG, lo que representa una mutación puntual intencional . Se estudiaron ratones homocigotos machos de dos a seis meses de edad mediante métodos científicos como ensayos bioquímicos y de comportamiento, resonancia magnética e histopatología. Los ratones homocigotos se compararon de forma rutinaria con ratones de control, ratones Pah -KO heterocigotos de la misma edad y sexo que expresaban suficiente actividad enzimática PAH para suministrar niveles de fenilalanina y tirosina similares a los ratones de tipo salvaje .
El modelo de ratón Pah -KO presentó niveles altos de fenilalanina en sangre y niveles bajos de tirosina, hipocolesterolemia , niveles altos de fenilalanina y niveles bajos de neurotransmisores y tirosina en el cerebro, hipomielinización, bajo peso cerebral y corporal, alto grado de patología ocular, hipopigmentación y un déficit conductual progresivo en comparación con los ratones heterocigotos. [31] Después de la terminación de los ratones homocigotos, no se detectaron proteínas hepáticas de PAH mediante análisis de transferencia Western . [33] La mayor cantidad de fenilalanina en homogenizados de cerebro completo de ratones homocigotos fue similar a la de los pacientes con PKU. El color del pelaje de ambos ratones dependía de la cantidad de pigmento de melanina en los tallos del pelo; por lo tanto, los ratones homocigotos eran propensos a ser de un marrón más claro en función de la menor presencia de melanina. El comportamiento de los ratones se probó con un ensayo de construcción de anidación. [31]
Este modelo establece el potencial para una investigación extensa de la biología de la PKU similar a la de los pacientes con PKU y para la evaluación de estrategias terapéuticas modernas para el tratamiento de la PKU.
La fenilalanina hidroxilasa está estrechamente relacionada con otras dos enzimas:
Las tres enzimas son homólogas, es decir, se cree que evolucionaron a partir de la misma hidroxilasa antigua.
