La espectroscopia de fluorescencia (también conocida como fluorimetría o espectrofluorometría ) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Consiste en utilizar un haz de luz, normalmente luz ultravioleta , que excita los electrones de las moléculas de determinados compuestos y hace que emitan luz; típicamente, pero no necesariamente, luz visible . Una técnica complementaria es la espectroscopia de absorción . En el caso especial de la espectroscopia de fluorescencia de una sola molécula, las fluctuaciones de intensidad de la luz emitida se miden a partir de fluoróforos individuales o de pares de fluoróforos.
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros .
Las moléculas tienen varios estados denominados niveles de energía . La espectroscopia de fluorescencia se ocupa principalmente de los estados electrónicos y vibratorios. Generalmente, la especie que se examina tiene un estado electrónico fundamental (un estado de baja energía) de interés y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos existen varios estados vibratorios. [1]
En la fluorescencia, la especie se excita primero, absorbiendo un fotón , desde su estado electrónico fundamental a uno de los diversos estados vibratorios en el estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas hacen que la molécula excitada pierda energía vibratoria hasta que alcance el estado vibratorio más bajo del estado electrónico excitado. Este proceso suele visualizarse con un diagrama de Jablonski . [1]
Luego, la molécula vuelve a descender a uno de los distintos niveles vibratorios del estado electrónico fundamental, emitiendo un fotón en el proceso. [1] Como las moléculas pueden caer a cualquiera de los varios niveles vibratorios en el estado fundamental, los fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Por tanto, analizando las diferentes frecuencias de la luz emitida en espectroscopia fluorescente, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles vibratorios.
Para las especies atómicas, el proceso es similar; sin embargo, dado que las especies atómicas no tienen niveles de energía vibratoria, los fotones emitidos suelen tener la misma longitud de onda que la radiación incidente. Este proceso de reemisión del fotón absorbido es "fluorescencia de resonancia" y, si bien es característico de la fluorescencia atómica, también se observa en la fluorescencia molecular. [2]
En una medición típica de fluorescencia (emisión), la longitud de onda de excitación es fija y la longitud de onda de detección varía, mientras que en una medición de excitación de fluorescencia la longitud de onda de detección es fija y la longitud de onda de excitación varía a lo largo de una región de interés. Un mapa de emisión se mide registrando los espectros de emisión resultantes de un rango de longitudes de onda de excitación y combinándolos todos. Se trata de un conjunto de datos de superficie tridimensional: intensidad de emisión en función de las longitudes de onda de excitación y emisión, y normalmente se representa como un mapa de contorno.
Existen dos tipos generales de instrumentos: fluorómetros de filtro que utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente y espectrofluorómetros que utilizan monocromadores de rejilla de difracción para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
Ambos tipos utilizan el siguiente esquema: la luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador e incide en la muestra. La muestra absorbe una proporción de la luz incidente y algunas de las moléculas de la muestra emiten fluorescencia. La luz fluorescente se emite en todas direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, que generalmente se coloca a 90° con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente transmitida o reflejada llegue al detector.
Se pueden utilizar diversas fuentes de luz como fuentes de excitación, incluidos láseres, LED y lámparas; En particular, los arcos de xenón y las lámparas de vapor de mercurio . Un láser solo emite luz de alta irradiancia en un intervalo de longitud de onda muy estrecho, generalmente inferior a 0,01 nm, lo que hace innecesario un monocromador o filtro de excitación. La desventaja de este método es que la longitud de onda de un láser no se puede cambiar mucho. Una lámpara de vapor de mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que emite luz cerca de las longitudes de onda máximas. Por el contrario, un arco de xenón tiene un espectro de emisión continuo con una intensidad casi constante en el rango de 300 a 800 nm y una irradiancia suficiente para mediciones hasta poco más de 200 nm.
En los fluorímetros se pueden utilizar filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite luz de una longitud de onda ajustable con una tolerancia ajustable. El tipo más común de monocromador utiliza una rejilla de difracción, es decir, la luz colimada ilumina una rejilla y sale con un ángulo diferente según la longitud de onda. Luego, el monocromador se puede ajustar para seleccionar qué longitudes de onda transmitir. Para permitir mediciones de anisotropía, es necesario agregar dos filtros de polarización: uno después del monocromador o filtro de excitación y otro antes del monocromador o filtro de emisión.
Como se mencionó anteriormente, la fluorescencia se mide con mayor frecuencia en un ángulo de 90° con respecto a la luz de excitación. Esta geometría se utiliza en lugar de colocar el sensor en la línea de la luz de excitación en un ángulo de 180° para evitar interferencias de la luz de excitación transmitida. Ningún monocromador es perfecto y transmitirá algo de luz parásita , es decir, luz con longitudes de onda distintas a la objetivo. Un monocromador ideal solo transmitiría luz en el rango especificado y tendría una alta transmisión independiente de la longitud de onda. Cuando se mide en un ángulo de 90°, sólo la luz dispersada por la muestra provoca luz parásita. Esto da como resultado una mejor relación señal-ruido y reduce el límite de detección en aproximadamente un factor 10000, [3] en comparación con la geometría de 180°. Además, la fluorescencia también se puede medir desde el frente, lo que suele hacerse en muestras turbias u opacas. [4]
El detector puede ser monocanal o multicanal. El detector monocanal sólo puede detectar la intensidad de una longitud de onda a la vez, mientras que el multicanal detecta la intensidad de todas las longitudes de onda simultáneamente, haciendo innecesario el monocromador o filtro de emisión.
Los fluorímetros más versátiles con monocromadores duales y una fuente de luz de excitación continua pueden registrar tanto un espectro de excitación como un espectro de fluorescencia. Al medir espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitación se mantiene constante, preferiblemente a una longitud de onda de alta absorción, y el monocromador de emisión explora el espectro. Para medir los espectros de excitación, la longitud de onda que pasa a través del filtro de emisión o monocromador se mantiene constante y el monocromador de excitación escanea. El espectro de excitación generalmente es idéntico al espectro de absorción ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorción. [5]
En concentraciones bajas, la intensidad de la fluorescencia será generalmente proporcional a la concentración del fluoróforo .
A diferencia de la espectroscopia UV/visible, los espectros "estándar" independientes del dispositivo no se obtienen fácilmente. Varios factores influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para lograr espectros "verdaderos", es decir, independientes de la máquina. Los diferentes tipos de distorsiones se clasificarán aquí como relacionadas con el instrumento o con la muestra. En primer lugar, se analiza la distorsión que surge del instrumento. Para empezar, las características de intensidad y longitud de onda de la fuente de luz varían con el tiempo durante cada experimento y entre cada experimento. Además, ninguna lámpara tiene una intensidad constante en todas las longitudes de onda. Para corregir esto, se puede aplicar un divisor de haz después del monocromador o filtro de excitación para dirigir una parte de la luz a un detector de referencia.
Además, se debe tener en cuenta la eficiencia de transmisión de monocromadores y filtros. Estos también pueden cambiar con el tiempo. La eficiencia de transmisión del monocromador también varía según la longitud de onda. Esta es la razón por la que se debe colocar un detector de referencia opcional después del monocromador o filtro de excitación. El porcentaje de fluorescencia captada por el detector también depende del sistema. Además, la eficiencia cuántica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, varía entre diferentes detectores, con la longitud de onda y con el tiempo, ya que el detector inevitablemente se deteriora.
Otros dos temas que deben considerarse incluyen la óptica utilizada para dirigir la radiación y los medios para sostener o contener el material de muestra (llamado cubeta o celda). Para la mayoría de las mediciones de UV, visible y NIR, es necesario el uso de cubetas de cuarzo de precisión. En ambos casos, es importante seleccionar materiales que tengan relativamente poca absorción en el rango de longitud de onda de interés. El cuarzo es ideal porque transmite entre 200 nm y 2500 nm; El cuarzo de mayor calidad puede incluso transmitir hasta 3500 nm, mientras que las propiedades de absorción de otros materiales pueden enmascarar la fluorescencia de la muestra.
La corrección de todos estos factores instrumentales para conseguir un espectro 'estándar' es un proceso tedioso, que en la práctica sólo se aplica cuando es estrictamente necesario. Este es el caso, por ejemplo, al medir el rendimiento cuántico o al encontrar la longitud de onda con la mayor intensidad de emisión.
Como se mencionó anteriormente, las distorsiones también surgen de la muestra. Por tanto, también hay que tener en cuenta algunos aspectos de la muestra. En primer lugar, la fotodescomposición puede disminuir la intensidad de la fluorescencia con el tiempo. También hay que tener en cuenta la dispersión de la luz. Los tipos de dispersión más importantes en este contexto son la dispersión de Rayleigh y Raman. La luz dispersada por la dispersión Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersión Raman la luz dispersada cambia de longitud de onda generalmente a longitudes de onda más largas. La dispersión Raman es el resultado de un estado electrónico virtual inducido por la luz de excitación. Desde este estado virtual , las moléculas pueden relajarse y volver a un nivel vibratorio distinto del estado vibratorio fundamental. [7] En los espectros de fluorescencia, siempre se ve con una diferencia de número de onda constante en relación con el número de onda de excitación, por ejemplo, el pico aparece en un número de onda 3600 cm −1 menor que la luz de excitación en el agua.
Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interno. [8] [9] Estos incluyen la reabsorción. La reabsorción ocurre porque otra molécula o parte de una macromolécula absorbe en las longitudes de onda en las que el fluoróforo emite radiación. Si este es el caso, algunos o todos los fotones emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidos nuevamente. Otro efecto de filtro interno se produce debido a las altas concentraciones de moléculas absorbentes, incluido el fluoróforo. El resultado es que la intensidad de la luz de excitación no es constante en toda la solución. De este modo, sólo un pequeño porcentaje de la luz de excitación llega a los fluoróforos visibles para el sistema de detección. Los efectos del filtro interno cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por lo tanto, deben tenerse en cuenta al analizar el espectro de emisión de la luz fluorescente. [5] [10]
La fluorescencia de una proteína plegada es una mezcla de la fluorescencia de residuos aromáticos individuales. La mayoría de las emisiones de fluorescencia intrínseca de una proteína plegada se deben a la excitación de residuos de triptófano , y algunas emisiones se deben a tirosina y fenilalanina; pero los enlaces disulfuro también tienen una absorción apreciable en este rango de longitudes de onda. Normalmente, el triptófano tiene una longitud de onda de absorción máxima de 280 nm y un pico de emisión solvatocrómico , que oscila entre ca. 300 a 350 nm dependiendo de la polaridad del entorno local [11] Por lo tanto, la fluorescencia de proteínas puede usarse como diagnóstico del estado conformacional de una proteína. [12] Además, la fluorescencia del triptófano está fuertemente influenciada por la proximidad de otros residuos ( es decir , grupos protonados cercanos como Asp o Glu pueden provocar la extinción de la fluorescencia de Trp). Además, es posible la transferencia de energía entre el triptófano y los otros aminoácidos fluorescentes, lo que afectaría al análisis, especialmente en los casos en los que se adopta el enfoque ácido de Förster. Además, el triptófano es un aminoácido relativamente raro; Muchas proteínas contienen sólo uno o unos pocos residuos de triptófano. Por lo tanto, la fluorescencia del triptófano puede ser una medida muy sensible del estado conformacional de residuos de triptófano individuales. La ventaja en comparación con las sondas extrínsecas es que la proteína en sí no cambia. El uso de fluorescencia intrínseca para el estudio de la conformación de proteínas se limita en la práctica a casos con pocos (o quizás solo uno) residuos de triptófano, ya que cada uno experimenta un entorno local diferente, lo que da lugar a diferentes espectros de emisión.
El triptófano es un importante fluorescente intrínseco (aminoácido), que puede utilizarse para estimar la naturaleza del microambiente del triptófano. Al realizar experimentos con desnaturalizantes, tensioactivos u otras moléculas anfifílicas , el microambiente del triptófano puede cambiar. Por ejemplo, si una proteína que contiene un solo triptófano en su núcleo "hidrófobo" se desnaturaliza al aumentar la temperatura, aparecerá un espectro de emisión desplazado al rojo. Esto se debe a la exposición del triptófano a un ambiente acuoso en lugar de un interior de proteína hidrofóbica. Por el contrario, la adición de un tensioactivo a una proteína que contiene un triptófano que está expuesto al disolvente acuoso provocará un espectro de emisión desplazado hacia el azul si el triptófano está incrustado en la vesícula o micela del tensioactivo . [13] Las proteínas que carecen de triptófano pueden acoplarse a un fluoróforo .
Con la excitación de la fluorescencia a 295 nm, el espectro de emisión de triptófano es dominante sobre la fluorescencia más débil de tirosina y fenilalanina .
La espectroscopia de fluorescencia se utiliza, entre otros, en los campos de investigación bioquímica, médica y química para analizar compuestos orgánicos . También se ha informado de su uso para diferenciar los tumores de piel malignos de los benignos.
Las técnicas de espectroscopía de fluorescencia atómica (AFS) son útiles en otros tipos de análisis/medición de un compuesto presente en el aire o el agua, u otros medios, como CVAFS , que se utiliza para la detección de metales pesados, como el mercurio.
La fluorescencia también se puede utilizar para redirigir fotones; consulte Colector solar fluorescente.
Además, la espectroscopía de fluorescencia se puede adaptar al nivel microscópico mediante microfluorimetría.
En química analítica se utilizan detectores de fluorescencia con HPLC .
En el campo de la investigación del agua, la espectroscopia de fluorescencia se puede utilizar para controlar la calidad del agua mediante la detección de contaminantes orgánicos. [14] Los avances recientes en informática y aprendizaje automático han permitido incluso la detección de contaminación bacteriana del agua [15]