La microfluorimetría es una adaptación de la fluorimetría para estudiar las propiedades bioquímicas y biofísicas de las células mediante el uso de microscopios para obtener imágenes de los componentes celulares marcados con moléculas fluorescentes . Es un tipo de microfotometría que proporciona una medida cuantitativa de la naturaleza cualitativa de la medición de la fluorescencia y, por lo tanto, permite obtener resultados definitivos que antes habrían sido imperceptibles a simple vista. [1]
La microfluorimetría tiene usos en muchos campos diferentes, incluyendo biología celular , microbiología , inmunología , análisis del ciclo celular y " cariotipo de flujo " de células. [2] En el cariotipo de flujo, los cromosomas metafásicos aislados se tiñen y se miden en un microfluorómetro de flujo. La tinción fluorescente de los cromosomas también puede dar una distribución sobre la frecuencia relativa de aparición y el contenido de ADN cromosómico de los cromosomas medidos. Esta técnica permite el cariotipo a velocidades más altas que con los métodos anteriores y se demostró que es precisa utilizando cromosomas de hámster chino. [3] La microfluorimetría de flujo (FMF) también se puede utilizar para determinar diferentes poblaciones de células utilizando marcadores fluorescentes con pequeñas muestras de células. Los marcadores utilizados para la medición en microfluorimetría de flujo están compuestos de antígenos fluorescentes o agentes de unión al ADN. [2] Permite la medición precisa de un anticuerpo que reacciona con un antígeno. [1] La microfluorimetría de flujo también se utiliza en la investigación farmacéutica para determinar el tipo de célula, la expresión de proteínas y ADN, el ciclo celular y otras propiedades de una célula durante el tratamiento farmacológico. [4] Por ejemplo, la microfluorimetría se utiliza en neuronas para comparar los efectos de las neurotoxinas tanto en la concentración de iones de calcio como en el potencial de membrana mitocondrial en células individuales. [5] La microfluorimetría también se puede utilizar como método para distinguir diferentes microorganismos entre sí mediante el análisis y la comparación del contenido de ADN de cada célula. [6] Este mismo concepto también se puede aplicar para distinguir entre tipos de células utilizando un tinte fluorescente adecuado que varía según el propósito y es una técnica fundamental en la biología celular y la genómica modernas. [7]
Otro uso de la microfluorometría es la citometría de flujo , que utiliza la emisión de moléculas de fluorocromo y, por lo general, un láser como fuente de luz para crear datos a partir de partículas y células. [8] Se puede utilizar para separar cromosomas a una velocidad muy alta y se utiliza fácilmente con la secuenciación de última generación. Esta técnica puede dar resultados simplemente separando solo los cromosomas relevantes a una velocidad muy rápida. [9] Por ejemplo, los bacteriófagos de E. coli lambda y T4 se pudieron separar mediante citometría de flujo, lo que permitió un análisis genómico que antes era difícil. [10]
La microfluorimetría se basa en el método establecido de medición fluorimétrica. Mediante el uso de un colorante que emite fluorescencia en presencia de un compuesto objetivo, la fluorimetría puede detectar la presencia del compuesto al determinar la presencia e intensidad de la fluorescencia. Las diferencias en la intensidad se pueden utilizar para determinar la concentración del compuesto. Además, si el colorante sufre un cambio espectral, se puede determinar la concentración absoluta del objetivo independientemente del conocimiento de la concentración del colorante. Fura-2 es un ejemplo de un colorante fluorescente utilizado para medir el calcio. La microfluorimetría amplía la fluorimetría al agregar un componente microscópico a las mediciones para permitir el análisis de células individuales y otros intereses microscópicos. [11]
Un microfluorómetro es un espectrofotómetro de fluorescencia combinado con un microscopio, diseñado para medir espectros de fluorescencia de muestras o áreas microscópicas o puede configurarse para medir los espectros de transmisión y reflectancia de áreas de muestras microscópicas. Puede ser un microfluorómetro completo construido exclusivamente para microespectroscopia de fluorescencia o la unidad de espectrómetro de fluorescencia que se conecta al puerto óptico de un microscopio. [12] Un microfluorómetro se puede utilizar para estimar cantidades y distribuciones de componentes químicos en células individuales o en cromosomas. Para estimar la cantidad de componentes químicos, su intensidad fluorescente se mide por fotometría fotoeléctrica mientras que la distribución se encuentra midiendo las intensidades de las fotos de las placas metafásicas de los cromosomas negativos. [13] Un microespectrofotómetro puede medir espectros de transmisión, absorbancia, reflectancia y emisión y luego, utilizando algoritmos incorporados, se produce un espectro que se puede comparar con datos anteriores para determinar la composición, la concentración, etc. [12]
Existen muchas fuentes de error en el proceso, pero los errores biológicos, como la incapacidad de preparar muestras homogéneas, tienen más probabilidades de ser una limitación que los errores técnicos. [1]
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