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Un fluorómetro , fluorímetro o fluorímetro es un dispositivo utilizado para medir parámetros de la fluorescencia del espectro visible : su intensidad y la distribución de longitudes de onda del espectro de emisión después de la excitación por un cierto espectro de luz . [1] Estos parámetros se utilizan para identificar la presencia y la cantidad de moléculas específicas en un medio. Los fluorómetros modernos son capaces de detectar concentraciones de moléculas fluorescentes tan bajas como 1 parte por billón.
El análisis de fluorescencia puede ser órdenes de magnitud más sensible que otras técnicas. Las aplicaciones incluyen química / bioquímica , medicina y monitoreo ambiental . Por ejemplo, se utilizan para medir la fluorescencia de la clorofila para investigar la fisiología de las plantas .
Por lo general, los fluorómetros utilizan un haz doble. Estos dos haces funcionan en conjunto para reducir el ruido creado por las fluctuaciones de la potencia radiante. El haz superior pasa a través de un filtro o monocromador y atraviesa la muestra. El haz inferior pasa a través de un atenuador y se ajusta para intentar igualar la potencia fluorescente emitida por la muestra. La luz de la fluorescencia de la muestra y el haz inferior, atenuado, son detectados por transductores separados y convertidos en una señal eléctrica que es interpretada por un sistema informático.
Dentro de la máquina, el transductor que detecta la fluorescencia creada a partir del haz superior se encuentra a cierta distancia de la muestra y en un ángulo de 90 grados con respecto al haz superior incidente. La máquina está construida de esta manera para disminuir la luz parásita del haz superior que puede incidir en el detector. El ángulo óptimo es de 90 grados. Existen dos enfoques diferentes para manejar la selección de la luz incidente que da lugar a diferentes tipos de fluorómetros. Si se utilizan filtros para seleccionar longitudes de onda de luz, la máquina se denomina fluorómetro. Mientras que un espectrofluorómetro normalmente utiliza dos monocromadores, algunos espectrofluorómetros pueden utilizar un filtro y un monocromador. Donde, en este caso, el filtro de banda ancha actúa para reducir la luz parásita, incluida la de los órdenes de difracción no deseados de la rejilla de difracción en el monocromador.
Las fuentes de luz para fluorómetros suelen depender del tipo de muestra que se esté analizando. Entre las fuentes de luz más comunes para fluorómetros se encuentra la lámpara de mercurio de baja presión . Esta proporciona muchas longitudes de onda de excitación, lo que la convierte en la más versátil. Sin embargo, esta lámpara no es una fuente continua de radiación. La lámpara de arco de xenón se utiliza cuando se necesita una fuente continua de radiación. Ambas fuentes proporcionan un espectro adecuado de luz ultravioleta que induce quimioluminiscencia . Estas son solo dos de las muchas fuentes de luz posibles. [ cita requerida ]
Las cubetas de vidrio y sílice suelen ser los recipientes en los que se coloca la muestra. Se debe tener cuidado de no dejar huellas dactilares ni ningún otro tipo de marca en el exterior de la cubeta, ya que esto puede producir fluorescencia no deseada. A veces se utilizan disolventes de "grado espectro", como el metanol, para limpiar las superficies de los recipientes y minimizar estos problemas.
La fluorimetría es ampliamente utilizada en la industria láctea para verificar si la pasteurización ha sido exitosa. Esto se hace utilizando un reactivo que se hidroliza a un fluoróforo y ácido fosfórico por la fosfatasa alcalina en la leche. [2] Si la pasteurización ha sido exitosa, la fosfatasa alcalina se desnaturalizará por completo y la muestra no emitirá fluorescencia. Esto funciona porque los patógenos en la leche mueren con cualquier tratamiento térmico que desnaturalice la fosfatasa alcalina. [3] [4]
Los productores de leche del Reino Unido exigen ensayos de fluorescencia para demostrar que se ha producido una pasteurización exitosa, [5] por lo que todas las lecherías del Reino Unido cuentan con equipos de fluorimetría.
Las tioflavinas son colorantes utilizados para tinción histológica y estudios biofísicos de agregación de proteínas. [6] Por ejemplo, la tioflavina T se utiliza en la técnica RT-QuIC para detectar priones mal plegados que causan encefalopatía espongiforme transmisible .
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Los fluorómetros se utilizan ampliamente en oceanografía para medir las concentraciones de clorofila basándose en la fluorescencia de clorofila de los pigmentos de las células del fitoplancton . La fluorescencia de la clorofila es un indicador ampliamente utilizado de la cantidad (biomasa) de algas microscópicas en el agua. En el laboratorio, después de tomar muestras de agua, los investigadores extraen los pigmentos de un filtro que tiene células de fitoplancton y luego miden la fluorescencia del extracto en un fluorómetro de mesa en una habitación oscura. [7] Para medir directamente la fluorescencia de la clorofila "in situ" (en el agua), los investigadores utilizan instrumentos diseñados para medir la fluorescencia ópticamente (por ejemplo, sondas con sensores ópticos electrónicos adicionales adjuntos). Los sensores ópticos emiten luz azul para excitar los pigmentos del fitoplancton y hacerlos fluorescer o emitir luz roja. El sensor mide esta fluorescencia inducida midiendo la luz roja como un voltaje, y el instrumento la guarda en un archivo de datos. La señal de voltaje del sensor se convierte en una concentración con una curva de calibración en el laboratorio, utilizando colorantes de color rojo como la rodamina , estándares como la fluoresceína o cultivos vivos de fitoplancton . [8]
La fluorescencia de la clorofila oceánica se mide en buques de investigación, pequeñas embarcaciones, boyas, muelles y embarcaderos en todo el mundo. Las mediciones de fluorometría se utilizan para mapear las concentraciones de clorofila en apoyo de la teledetección del color del océano . Los fluorómetros especiales para aguas oceánicas pueden medir propiedades más allá de la cantidad total de fluorescencia, como el rendimiento cuántico de la fotoquímica , el momento de la fluorescencia y la fluorescencia de las células cuando se someten a cantidades crecientes de luz. [9] Las operaciones de acuicultura, como las piscifactorías, utilizan fluorómetros para medir la disponibilidad de alimentos para animales que se alimentan por filtración, como los mejillones [10] y para detectar la aparición de floraciones de algas nocivas (FAN) y/o " mareas rojas " (no necesariamente lo mismo). [11]
Los fluorómetros se pueden utilizar para determinar la concentración de ácido nucleico en una muestra. [12]
Existen dos tipos básicos de fluorómetros: los fluorómetros de filtro y los espectrofluorómetros. La diferencia entre ellos es la forma en que seleccionan las longitudes de onda de la luz incidente; los fluorómetros de filtro utilizan filtros, mientras que los espectrofluorómetros utilizan monocromadores de rejilla. Los fluorómetros de filtro suelen adquirirse o construirse a un coste menor, pero son menos sensibles y tienen menos resolución que los espectrofluorómetros. Los fluorómetros de filtro también pueden funcionar únicamente en las longitudes de onda de los filtros disponibles, mientras que los monocromadores suelen poder ajustarse libremente en un rango relativamente amplio. La posible desventaja de los monocromadores surge de esa misma propiedad, porque el monocromador es capaz de calibrarse o ajustarse incorrectamente, mientras que la longitud de onda de los filtros es fija cuando se fabrican.