Proceso de alteración parcial o total de las estructuras nativas secundarias, y/o terciarias y/o cuaternarias de proteínas o ácidos nucleicos que resulta en una pérdida de bioactividad .
Nota 1 : Modificado a partir de la definición dada en la referencia [1]
Nota 2 : La desnaturalización puede ocurrir cuando las proteínas y los ácidos nucleicos se someten a temperaturas elevadas o a valores extremos de pH, o a concentraciones no fisiológicas de sal, disolventes orgánicos, urea u otros agentes químicos.
Nota 3 : Una enzima pierde su capacidad de alterar o acelerar una reacción química cuando se desnaturaliza. [2]
En bioquímica , la desnaturalización es un proceso en el que las proteínas o los ácidos nucleicos pierden la estructura plegada presente en su estado nativo debido a varios factores, incluida la aplicación de algún estrés externo o compuesto, como un ácido o base fuerte, una sal inorgánica concentrada , un disolvente orgánico (por ejemplo, alcohol o cloroformo ), agitación y radiación, o calor . [3] Si las proteínas de una célula viva se desnaturalizan, esto da como resultado la interrupción de la actividad celular y posiblemente la muerte celular . La desnaturalización de proteínas también es una consecuencia de la muerte celular. [4] [5] Las proteínas desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de características, desde cambio conformacional y pérdida de solubilidad o disociación de cofactores hasta agregación debido a la exposición de grupos hidrófobos . La pérdida de solubilidad como resultado de la desnaturalización se llama coagulación . [6] Las proteínas desnaturalizadas pierden su estructura 3D y, por lo tanto, no pueden funcionar.
El plegamiento adecuado de las proteínas es fundamental para que una proteína globular o de membrana pueda realizar su trabajo correctamente; debe plegarse a su forma original para funcionar. Sin embargo, los enlaces de hidrógeno y la unión de los cofactores con las proteínas, que desempeñan un papel crucial en el plegamiento, son bastante débiles y, por lo tanto, se ven fácilmente afectados por el calor, la acidez, las concentraciones variables de sal, los agentes quelantes y otros factores estresantes que pueden desnaturalizar la proteína. Esta es una de las razones por las que la homeostasis celular es fisiológicamente necesaria en la mayoría de las formas de vida .
Cuando se cocinan los alimentos, algunas de sus proteínas se desnaturalizan. Por eso los huevos cocidos se ponen duros y la carne cocida se pone firme.
Un ejemplo clásico de desnaturalización de proteínas proviene de las claras de huevo, que suelen ser en gran parte albúminas de huevo en agua. Recién sacadas del huevo, las claras de huevo son transparentes y líquidas. Cocinar las claras térmicamente inestables las vuelve opacas, formando una masa sólida interconectada. [7] La misma transformación se puede lograr con un producto químico desnaturalizante. Verter claras de huevo en un vaso de precipitados con acetona también las volverá translúcidas y sólidas. La piel que se forma en la leche cuajada es otro ejemplo común de proteína desnaturalizada. El aperitivo frío conocido como ceviche se prepara "cocinando" químicamente pescado y mariscos crudos en una marinada cítrica ácida, sin calor. [8]
Las proteínas desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de características, desde pérdida de solubilidad hasta agregación de proteínas .
Las proteínas o polipéptidos son polímeros de aminoácidos . Una proteína es creada por ribosomas que "leen" el ARN codificado por codones en el gen y ensamblan la combinación de aminoácidos requerida a partir de la instrucción genética , en un proceso conocido como traducción . La cadena de proteína recién creada luego sufre una modificación postraduccional , en la que se agregan átomos o moléculas adicionales, por ejemplo, cobre , zinc o hierro . Una vez que se ha completado este proceso de modificación postraduccional, la proteína comienza a plegarse (a veces de manera espontánea y a veces con asistencia enzimática ), enroscándose sobre sí misma de modo que los elementos hidrófobos de la proteína quedan enterrados en lo profundo de la estructura y los elementos hidrófilos terminan en el exterior. La forma final de una proteína determina cómo interactúa con su entorno.
El plegamiento de proteínas consiste en un equilibrio entre una cantidad sustancial de interacciones intramoleculares débiles dentro de una proteína ( interacciones hidrofóbicas, electrostáticas y de Van Der Waals) e interacciones proteína-solvente. [9] Como resultado, este proceso depende en gran medida del estado ambiental en el que reside la proteína. [9] Estas condiciones ambientales incluyen, entre otras, la temperatura , la salinidad , la presión y los solventes involucrados. [9] En consecuencia, cualquier exposición a tensiones extremas (por ejemplo, calor o radiación, altas concentraciones de sales inorgánicas, ácidos y bases fuertes) puede alterar la interacción de una proteína y conducir inevitablemente a la desnaturalización. [10]
Cuando se desnaturaliza una proteína, se alteran las estructuras secundarias y terciarias, pero los enlaces peptídicos de la estructura primaria entre los aminoácidos se dejan intactos. Dado que todos los niveles estructurales de la proteína determinan su función, la proteína ya no puede realizar su función una vez que se ha desnaturalizado. Esto contrasta con las proteínas intrínsecamente desestructuradas , que están desplegadas en su estado nativo , pero aún son funcionalmente activas y tienden a plegarse al unirse a su objetivo biológico. [11]
La mayoría de los sustratos biológicos pierden su función biológica cuando se desnaturalizan. Por ejemplo, las enzimas pierden su actividad , porque los sustratos ya no pueden unirse al sitio activo , [13] y porque los residuos de aminoácidos involucrados en la estabilización de los estados de transición de los sustratos ya no están posicionados para poder hacerlo. El proceso de desnaturalización y la pérdida de actividad asociada se pueden medir utilizando técnicas como la interferometría de polarización dual , CD , QCM-D y MP-SPR .
Se sabe que los metales pesados, al dirigirse a las proteínas, alteran la función y la actividad que llevan a cabo las proteínas. [14] Los metales pesados se dividen en categorías que consisten en metales de transición, así como una cantidad selecta de metaloides . [14] Estos metales, cuando interactúan con proteínas nativas plegadas, tienden a desempeñar un papel en la obstrucción de su actividad biológica. [14] Esta interferencia se puede llevar a cabo de diferentes formas. Estos metales pesados pueden formar un complejo con los grupos funcionales de la cadena lateral presentes en una proteína o formar enlaces con tioles libres. [14] Los metales pesados también desempeñan un papel en la oxidación de las cadenas laterales de aminoácidos presentes en las proteínas. [14] Junto con esto, al interactuar con metaloproteínas, los metales pesados pueden dislocar y reemplazar iones metálicos clave. [14] Como resultado, los metales pesados pueden interferir con las proteínas plegadas, lo que puede disuadir en gran medida la estabilidad y la actividad de las proteínas.
En muchos casos, la desnaturalización es reversible (las proteínas pueden recuperar su estado nativo cuando se elimina la influencia desnaturalizante). Este proceso puede llamarse renaturalización . [15] Esta comprensión ha llevado a la noción de que toda la información necesaria para que las proteínas asuman su estado nativo estaba codificada en la estructura primaria de la proteína y, por lo tanto, en el ADN que codifica la proteína, la llamada " hipótesis termodinámica de Anfinsen ". [16]
La desnaturalización también puede ser irreversible. Esta irreversibilidad es típicamente cinética, no termodinámica, ya que una proteína plegada generalmente tiene menor energía libre que cuando está desplegada. A través de la irreversibilidad cinética, el hecho de que la proteína esté atrapada en un mínimo local puede impedir que vuelva a plegarse después de haber sido desnaturalizada irreversiblemente. [17]
La desnaturalización también puede ser causada por cambios en el pH que pueden afectar la química de los aminoácidos y sus residuos. Los grupos ionizables en los aminoácidos pueden ionizarse cuando se producen cambios en el pH. Un cambio de pH a condiciones más ácidas o más básicas puede inducir el desdoblamiento. [18] El desdoblamiento inducido por ácido a menudo ocurre entre pH 2 y 5, el desdoblamiento inducido por base generalmente requiere un pH 10 o superior. [18]
Los ácidos nucleicos (incluidos el ARN y el ADN ) son polímeros de nucleótidos sintetizados por enzimas polimerasas durante la transcripción o la replicación del ADN . Después de la síntesis 5'-3' de la cadena principal, las bases nitrogenadas individuales son capaces de interactuar entre sí a través de enlaces de hidrógeno , lo que permite la formación de estructuras de orden superior. La desnaturalización de los ácidos nucleicos se produce cuando se interrumpe el enlace de hidrógeno entre los nucleótidos y da como resultado la separación de las cadenas previamente hibridadas . Por ejemplo, la desnaturalización del ADN debido a altas temperaturas da como resultado la interrupción de los pares de bases y la separación de la hélice bicatenaria en dos cadenas simples. Las cadenas de ácidos nucleicos son capaces de volver a hibridarse cuando se restablecen las condiciones " normales ", pero si la restauración se produce demasiado rápido, las cadenas de ácidos nucleicos pueden volver a hibridarse de manera imperfecta, lo que da como resultado el emparejamiento incorrecto de las bases.
Las interacciones no covalentes entre cadenas antiparalelas del ADN se pueden romper para "abrir" la doble hélice cuando se prevé que se produzcan mecanismos biológicamente importantes, como la replicación del ADN, la transcripción, la reparación del ADN o la unión de proteínas. [19] La zona de ADN parcialmente separado se conoce como burbuja de desnaturalización, que se puede definir más específicamente como la apertura de una doble hélice de ADN a través de la separación coordinada de pares de bases. [19]
El primer modelo que intentó describir la termodinámica de la burbuja de desnaturalización se introdujo en 1966 y se denominó Modelo de Poland-Scheraga. Este modelo describe la desnaturalización de las cadenas de ADN en función de la temperatura . A medida que aumenta la temperatura, los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases se alteran cada vez más y comienzan a formarse "bucles desnaturalizados". [20] Sin embargo, el Modelo de Poland-Scheraga ahora se considera elemental porque no tiene en cuenta las implicaciones confusas de la secuencia de ADN , la composición química, la rigidez y la torsión . [21]
Estudios termodinámicos recientes han inferido que la duración de una burbuja de desnaturalización singular varía de 1 microsegundo a 1 milisegundo. [22] Esta información se basa en escalas de tiempo establecidas de replicación y transcripción de ADN. [22] Actualmente, [ ¿cuándo? ] se están realizando estudios de investigación biofísica y bioquímica para dilucidar más completamente los detalles termodinámicos de la burbuja de desnaturalización. [22]
Dado que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es uno de los contextos más populares en los que se desea la desnaturalización del ADN, el calentamiento es el método de desnaturalización más frecuente. [23] Además de la desnaturalización por calor, los ácidos nucleicos pueden sufrir el proceso de desnaturalización a través de varios agentes químicos como formamida , guanidina , salicilato de sodio , dimetilsulfóxido (DMSO), propilenglicol y urea . [24] Estos agentes desnaturalizantes químicos reducen la temperatura de fusión (Tm ) al competir por los donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno con pares de bases nitrogenadas preexistentes . Algunos agentes incluso pueden inducir la desnaturalización a temperatura ambiente. Por ejemplo, se ha demostrado que los agentes alcalinos (p. ej., NaOH) desnaturalizan el ADN al cambiar el pH y eliminar los protones que contribuyen a los enlaces de hidrógeno. [23] Estos desnaturalizantes se han empleado para fabricar gel de electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), que promueve la desnaturalización de los ácidos nucleicos para eliminar la influencia de la forma del ácido nucleico en su movilidad electroforética . [25]
La actividad óptica (absorción y dispersión de la luz) y las propiedades hidrodinámicas ( difusión traslacional , coeficientes de sedimentación y tiempos de correlación rotacional ) de los ácidos nucleicos desnaturalizados con formamida son similares a las de los ácidos nucleicos desnaturalizados por calor. [24] [26] [27] Por lo tanto, dependiendo del efecto deseado, la desnaturalización química del ADN puede proporcionar un procedimiento más suave para desnaturalizar los ácidos nucleicos que la desnaturalización inducida por calor. Los estudios que comparan diferentes métodos de desnaturalización, como el calentamiento, el molino de perlas de diferentes tamaños de perlas, la sonicación de la sonda y la desnaturalización química, muestran que la desnaturalización química puede proporcionar una desnaturalización más rápida en comparación con los otros métodos de desnaturalización física descritos. [23] Particularmente en los casos en los que se desea una renaturalización rápida, los agentes de desnaturalización química pueden proporcionar una alternativa ideal al calentamiento. Por ejemplo, las cadenas de ADN desnaturalizadas con agentes alcalinos como NaOH se renaturalizan tan pronto como se agrega el tampón de fosfato . [23]
Las moléculas pequeñas y electronegativas , como el nitrógeno y el oxígeno , que son los gases primarios del aire , afectan significativamente la capacidad de las moléculas circundantes para participar en la formación de enlaces de hidrógeno . [28] Estas moléculas compiten con los aceptores de enlaces de hidrógeno circundantes por los donantes de enlaces de hidrógeno, actuando así como "rompedores de enlaces de hidrógeno" y debilitando las interacciones entre las moléculas circundantes en el entorno. [28] Las hebras antiparalelas en las dobles hélices de ADN están unidas de forma no covalente por enlaces de hidrógeno entre pares de bases; [29] por lo tanto, el nitrógeno y el oxígeno mantienen el potencial de debilitar la integridad del ADN cuando se exponen al aire. [30] Como resultado, las hebras de ADN expuestas al aire requieren menos fuerza para separarse y ejemplifican temperaturas de fusión más bajas . [30]
Muchas técnicas de laboratorio dependen de la capacidad de las cadenas de ácidos nucleicos para separarse. Al comprender las propiedades de la desnaturalización de los ácidos nucleicos, se crearon los siguientes métodos:
Los desnaturalizantes de proteínas ácidas incluyen:
Las bases funcionan de manera similar a los ácidos en la desnaturalización. Entre ellas se encuentran:
La mayoría de los disolventes orgánicos son desnaturalizantes, incluidos: [ cita requerida ]
Los agentes de reticulación para proteínas incluyen: [ cita requerida ]
Los agentes caotrópicos incluyen: [ cita requerida ]
Los agentes que rompen los enlaces disulfuro por reducción incluyen: [ cita requerida ]
Agentes como el peróxido de hidrógeno, el cloro elemental, el ácido hipocloroso (agua clorada), el bromo, el agua de bromo, el yodo, los ácidos nítrico y oxidantes y el ozono reaccionan con fracciones sensibles como el sulfuro/tiol y los anillos aromáticos activados (fenilalanina) dañan la proteína y la vuelven inútil.
Los desnaturalizantes ácidos de ácidos nucleicos incluyen:
Los desnaturalizantes básicos de ácidos nucleicos incluyen:
Otros desnaturalizantes de ácidos nucleicos incluyen:
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