El ditiotreitol ( DTT ) es un compuesto organosulfurado con la fórmula (CH(OH)CH2SH ) 2 . Es un compuesto incoloro y se clasifica como ditiol y diol . El DTT es un reactivo redox también conocido como reactivo de Cleland , en honor a W. Wallace Cleland . [2] El reactivo se utiliza comúnmente en su forma racémica. Su nombre deriva del azúcar de cuatro carbonos , treosa . El DTT tiene un compuesto epimérico ('hermano'), el ditioeritritol (DTE).
El DTT es un agente reductor ; una vez oxidado, forma un anillo estable de seis miembros con un enlace disulfuro interno . Tiene un potencial redox de −0,33 V a pH 7. [1] La reducción de un enlace disulfuro típico se produce mediante dos reacciones secuenciales de intercambio tiol-disulfuro y se ilustra a continuación. La reducción generalmente no se detiene en las especies de disulfuro mixto porque el segundo tiol del DTT tiene una alta propensión a cerrar el anillo, formando DTT oxidado y dejando atrás un enlace disulfuro reducido . El poder reductor del DTT está limitado a valores de pH superiores a 7, ya que solo la forma de tiolato cargada negativamente -S − es reactiva (la forma de tiol protonada -SH no lo es); el pKa de los grupos tiol es 9,2 y 10,1.
El DTT se utiliza como agente reductor o "desprotector" del ADN tiolado. Los átomos de azufre terminales del ADN tiolado tienen tendencia a formar dímeros en solución, especialmente en presencia de oxígeno. La dimerización reduce en gran medida la eficiencia de las reacciones de acoplamiento posteriores, como la inmovilización del ADN sobre oro en los biosensores. Normalmente, el DTT se mezcla con una solución de ADN y se deja reaccionar, y luego se elimina por filtración (para el catalizador sólido) o por cromatografía (para la forma líquida). El procedimiento de eliminación del DTT a menudo se denomina "desalinización". Generalmente, el DTT se utiliza como agente protector que evita la oxidación de los grupos tiol .
El DTT se utiliza con frecuencia para reducir los enlaces disulfuro de las proteínas y, de forma más general, para evitar que se formen enlaces disulfuro intramoleculares e intermoleculares entre los residuos de cisteína de las proteínas. Sin embargo, incluso el DTT no puede reducir los enlaces disulfuro enterrados (inaccesibles a los disolventes), por lo que la reducción de los enlaces disulfuro a veces se lleva a cabo en condiciones desnaturalizantes (p. ej., a altas temperaturas o en presencia de un desnaturalizante fuerte como cloruro de guanidinio 6 M, urea 8 M o dodecilsulfato de sodio al 1 % ). El DTT se utiliza a menudo junto con el dodecilsulfato de sodio en SDS-PAGE para desnaturalizar aún más las proteínas reduciendo sus enlaces disulfuro para permitir una mejor separación de las proteínas durante la electroforesis . Debido a la capacidad de reducir los enlaces disulfuro, el DTT se puede utilizar para desnaturalizar CD38 en los glóbulos rojos. El DTT también desnaturaliza los antígenos de los sistemas de grupos sanguíneos Kell, Lutheran, Dombrock, Cromer, Cartwright, LW y Knops. Por el contrario, la exposición a disolventes de diferentes enlaces disulfuro se puede analizar por su tasa de reducción en presencia de DTT.
El DTT también puede utilizarse como agente oxidante . Su principal ventaja es que efectivamente no se forman especies de disulfuro mixto, a diferencia de otros agentes como el glutatión . En casos muy raros, puede formarse un aducto de DTT, es decir, los dos átomos de azufre del DTT pueden formar enlaces disulfuro con diferentes átomos de azufre; en tales casos, el DTT no puede ciclarse ya que no tiene tales tioles libres restantes.
El DTT se oxida por el aire, por lo que normalmente se almacena y se manipula en una atmósfera inerte para minimizar la oxidación. La velocidad de oxidación por aire es más lenta a bajas temperaturas. [3] El DTT oxidado exhibe un pico de absorbancia fuerte a 280 nm. Dado que los tioles son menos nucleófilos que sus bases conjugadas, los tiolatos , el DTT se convierte en un nucleófilo menos potente a medida que baja el pH. El (2 S )-2-amino-1,4-dimercaptobutano ( ditiobutilamina o DTBA), un agente reductor de ditiol relacionado, supera en cierta medida esta limitación del DTT. [4] La tris(2-carboxietil)fosfina ( TCEP ) es un agente reductor alternativo que es más estable y eficaz a pH bajo, pero es voluminoso y reduce las cistinas en las proteínas plegadas solo lentamente. [5]
La vida media del DTT es de 40 horas a un pH de 6,5 y de 1,4 horas a un pH de 8,5 y 20 °C; su vida media disminuye aún más a medida que aumenta la temperatura. La presencia de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) para quelar iones metálicos divalentes extiende considerablemente la vida media del DTT en solución. [6]
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