La adenilosuccinato liasa es parte de la superfamilia de enzimas de eliminación β y procede a través de un mecanismo de reacción E1cb . La enzima es un homotetrámero con tres dominios en cada monómero y cuatro sitios activos por homotetrámero.
Este diagrama de flujo muestra los pasos en la biosíntesis de AMP. Los pasos en verde muestran los pasos catalizados por ASL. Los pasos en rojo muestran la desfosforilación de los sustratos de ASL.
La adenilosuccinato liasa (ASL) es una enzima que cataliza dos reacciones en la vía biosintética de novo de las purinas . En ambas reacciones utiliza un mecanismo de reacción de eliminación E1cb para separar el fumarato del sustrato. En la primera reacción, ASL convierte 5-aminoimidazol-(N-succinilocarboxamida) ribotida (SAICAR) en 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribotida (AICAR) y fumarato. AICAR pasa por tres reacciones más antes de convertirse en adenilosuccinato (también llamado monofosfato de succiniladenosina o SAMP), que luego ASL se divide en monofosfato de adenosina (AMP) y fumarato. [8] ASL es importante para las células no solo por su participación en la creación de purinas necesarias para la replicación celular , sino también porque ayuda a regular los procesos metabólicos al controlar los niveles de AMP y fumarato en la célula. [9]
ASL escinde SAICAR en AICAR y fumarato, y adenilosuccinato en AMP y fumarato. Esta figura se inspiró en una de un artículo de Toth y Yeates. [5]
Estructura
Subunidades
La adenilosuccinato liasa pertenece a la superfamilia de eliminación β y, como tal, su estructura es un homotetrámero. El monómero de adenilosuccinato liasa tiene tres dominios. En Thermotoga maritima , el dominio 1 contiene 7 hélices α en los residuos 1-93, incluido His68, que está altamente conservado y anteriormente se pensaba que era el ácido catalítico en el sitio activo . [5] Estudios más recientes han postulado que His171 en el dominio 2, que anteriormente se pensaba que era una base catalítica , puede en realidad estar actuando como ácido catalítico, al menos en Escherichia coli . [9] El dominio 2 está formado por los residuos 94-341 y contiene 5 hélices α y la única hoja β del monómero . El dominio 3 está formado por 7 hélices α. El núcleo del tetrámero está formado por las cuatro copias del dominio 2, y hay dos copias de cada uno de los dominios 1 y 3 en cada extremo del tetrámero, lo que da al tetrámero D2 simetría diédrica . El tetrámero tiene cuatro sitios activos, cada uno donde se encuentran tres dominios. [5]
La adenilosuccinato liasa en humanos y Bacillus subtilis puede ser inhibida competitivamente por el sustrato análogo del ácido adenosina fosfonobutírico 2'(3'), 5'-difosfato (APBADP). APBADP es un inhibidor competitivo para ambas reacciones catalizadas por adenilosuccinato liasa, y los estudios cinéticos con APBADP muestran que los sustratos para ambas reacciones utilizan el mismo sitio activo. [10] En la reacción catalizada por ASL que divide el adenilosuccinato en monofosfato de adenosina (AMP) y fumarato, el AMP debe girar ligeramente después de que se completa la reacción y antes de que se libere el fumarato para que ambos productos encajen en el sitio activo. [11]
Mutaciones
Los mutantes de adenilosuccinato liasa pueden tener una actividad considerablemente reducida ya sea que la mutación esté dentro o fuera del sitio activo. Los mutantes de ASL R396C y R396H que causan enfermedades están en la entrada del sitio activo y tienen un Vmax más bajo que el ASL de tipo salvaje, pero los mutantes K246E y L311V que están lejos del sitio activo también causan una Vmax disminuida . El mutante R194C de ASL está alejado del sitio activo y, aunque mantiene un V máx similar al ASL de tipo salvaje, se demostró que es el menos estable conformacionalmente de los cinco mutantes in vitro y aún causa enfermedad. [12]
Mecanismo
Anteriormente se pensaba que el mecanismo de acción de la adenilosuccinato liasa era una catálisis concertada en la que el hidrógeno del carbono β (con respecto al nitrógeno saliente) era extraído por la base catalítica al mismo tiempo que el nitrógeno saliente era protonado por la Ácido catalítico para la eliminación de E2. [5] Datos más recientes entran en conflicto con esta idea y han confirmado que el mecanismo no es, de hecho, concertado, sino que la abstracción ocurre primero y hay una especie de carbanión intermedia que está estabilizada por resonancia. Para ambas reacciones catalizadas por ASL, primero se produce la desprotonación del carbono β al nitrógeno saliente, luego se produce la formación y estabilización por resonancia del carbanión y, por último, la protonación del nitrógeno saliente que provoca la ruptura del enlace CN. [9] La confirmación experimental de la desprotonación, la formación de carbaniones y el paso limitante de la velocidad de la protonación que causa la escisión significa que se trata de un mecanismo E1cb. Los datos más recientes sugieren que el ácido catalítico es His171, que anteriormente se pensaba que era la base catalítica, y que, de manera algo inusual, es una serina en la posición 295 que actúa como base catalítica. La escisión del adenilosuccinato en AMP y fumarato es un mecanismo uni-bi ordenado, lo que significa que después de la escisión el fumarato abandona el sitio activo antes que el AMP. [13]
Mecanismo de acción de ASL. Primero, el ácido desprotona el carbono β, luego se forma un carbanión y se estabiliza por resonancia, por último, el nitrógeno acepta un protón y se escinde el enlace CN. Esta figura se inspiró en un artículo de Tsai et al. [9] NOTA: la estructura del fumarato en esta figura es incorrecta. Debe haber un doble enlace, en configuración trans, entre los átomos de carbono 2 y 3.
Papel en la enfermedad
La adenilosuccinato liasa mutada (ASL) causa una enfermedad clínica en pacientes que se conoce como deficiencia de adenilosuccinato liasa . Esta afección es poco común y se presenta con diversos grados de retraso psicomotor , autismo , atrofia muscular y epilepsia . [14] [15] Se desconoce la causa exacta de la enfermedad, pero las posibilidades incluyen una síntesis insuficiente de nucleótidos de purina para la replicación celular , un mal funcionamiento del ciclo de nucleótidos de purina y una acumulación de sustratos a niveles tóxicos. Se han identificado varias mutaciones puntuales relacionadas con enfermedades, y aquellos que son heterocigotos para una mutación puntual están sanos, pero aquellos que son homocigotos desarrollan la enfermedad clínica. [16] El número de genotipos que causan enfermedades sigue aumentando a medida que se descubren más mutaciones, y hasta ahora se han identificado treinta mutaciones puntuales diferentes, y una deleción, que causan la deficiencia de adenilosuccinato liasa. [17]
Cuando los sustratos de ASL (adenilosuccinato y SAICAR) se acumulan debido a una deficiencia enzimática, se desfosforilan y se convierten en succiniladenosina (S-Ado) y succinilaminoimidazol carboximida ribósido (SAICA ribósido). [18] Normalmente, estos compuestos no están presentes en el líquido cefalorraquídeo ni en la orina porque el ASL actúa sobre la mayoría de las moléculas de sustrato antes de que puedan acumularse y fosforilarse. [15] En el pasado no existía una buena prueba para detectar la deficiencia de adenilosuccinato liasa, lo que dificultaba el diagnóstico de esta rara enfermedad, pero recientemente se desarrolló una prueba para detectar SAICA y S-Ado en la orina. La prueba es económica y no tuvo falsos positivos ni falsos negativos en la pequeña muestra de los investigadores. [19]
Se cree que el ribósido de SAICA puede ser el compuesto más tóxico, ya que se encuentra en niveles más altos en pacientes con síntomas clínicos graves, y algunos investigadores piensan que el S-Ado puede incluso tener un efecto protector. Es necesario realizar más investigaciones sobre lo que determina la gravedad de la enfermedad, pero la inestabilidad del ASL humano en el laboratorio ha sido un obstáculo para esta investigación. [17]
Aplicaciones terapéuticas
A medida que aumenta la resistencia a los antipalúdicos, los investigadores buscan nuevas estrategias para atacar los parásitos Plasmodium que causan la malaria , especialmente el más letal P. falciparum . Algunos investigadores sugirieron que se considere el ASL como un posible objetivo farmacológico porque, aunque la interrupción de la vía de biosíntesis de novo de purinas es tóxica para el huésped, Plasmodium ASL tiene un bajo nivel de homología de secuencia con el ASL humano, lo que puede hacer que cualquier fármaco anti- Plasmodium ASL lo suficientemente específico como para no dañar a los huéspedes humanos. [20]
Referencias
^ abc GRCh38: Ensembl lanzamiento 89: ENSG00000239900 - Ensembl , mayo de 2017
^ abc GRCm38: Ensembl lanzamiento 89: ENSMUSG00000022407 - Ensembl , mayo de 2017
^ "Referencia humana de PubMed:". Centro Nacional de Información Biotecnológica, Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
^ "Referencia de PubMed del ratón:". Centro Nacional de Información Biotecnológica, Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
^ abcde Toth EA, Yeates TO (febrero de 2000). "La estructura de la adenilosuccinato liasa, una enzima con actividad dual en la vía biosintética de novo de las purinas". Estructura . 8 (2): 163–74. doi : 10.1016/S0969-2126(00)00092-7 . PMID 10673438.
^ "Entrez Gene: adenilosuccinato liasa" . Consultado el 1 de marzo de 2012 .
^ Selwood T, Jaffe EK (marzo de 2012). "Homooligómeros de disociación dinámica y control de la función proteica". Archivos de Bioquímica y Biofísica . 519 (2): 131–43. doi :10.1016/j.abb.2011.11.020. PMC 3298769 . PMID 22182754.
^ Spiegel EK, Colman RF, Patterson D (2006). "Deficiencia de adenilosuccinato liasa". Genética molecular y metabolismo . 89 (1–2): 19–31. doi :10.1016/j.ymgme.2006.04.018. PMID 16839792.
^ abcd Tsai M, Koo J, Yip P, Colman RF, Segall ML, Howell PL (julio de 2007). "Los complejos de sustrato y producto de la adenilosuccinato liasa de Escherichia coli proporcionan nuevos conocimientos sobre el mecanismo enzimático". Revista de biología molecular . 370 (3): 541–54. doi :10.1016/j.jmb.2007.04.052. PMC 4113493 . PMID 17531264.
^ Sivendran S, Colman RF (julio de 2008). "Efecto de un nuevo análogo de sustrato no escindible sobre mutantes de serina y de tipo salvaje en la secuencia característica de la adenilosuccinato liasa de Bacillus subtilis y Homo sapiens". Ciencia de las proteínas . 17 (7): 1162–74. doi :10.1110/ps.034777.108. PMC 2442012 . PMID 18469177.
^ Kozlov G, Nguyen L, Pearsall J, Gehring K (septiembre de 2009). "La estructura de la adenilosuccinato liasa de Escherichia coli unida a fosfato identifica His171 como un ácido catalítico". Acta Crystallographica Sección F. 65 (parte 9): 857–61. doi :10.1107/S1744309109029674. PMC 2795585 . PMID 19724117.
^ Ariyananda Lde Z, Lee P, Antonopoulos C, Colman RF (junio de 2009). "Análisis bioquímico y biofísico de cinco mutantes de adenilosuccinato liasa humana asociados a enfermedades". Bioquímica . 48 (23): 5291–302. doi :10.1021/bi802321m. PMC 2745324 . PMID 19405474.
^ Bulusu V, Srinivasan B, Bopanna MP, Balaram H (abril de 2009). "Aclaración de la especificidad de sustrato, mecanismo cinético y catalítico de la adenilosuccinato liasa de Plasmodium falciparum". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteínas y Proteómica . 1794 (4): 642–54. doi :10.1016/j.bbapap.2008.11.021. PMID 19111634.
^ Maaswinkel-Mooij PD, Laan LA, Onkenhout W, Brouwer OF, Jaeken J, Poorthuis BJ (agosto de 1997). "La deficiencia de adenilosuccinasa se presenta con epilepsia en la primera infancia". Revista de enfermedades metabólicas hereditarias . 20 (4): 606–7. doi :10.1023/A:1005323512982. PMID 9266401. S2CID 52833816.
^ ab Lee P, Colman RF (febrero de 2007). "Expresión, purificación y caracterización de adenilosuccinato liasa humana recombinante estable". Expresión y purificación de proteínas . 51 (2): 227–34. doi : 10.1016/j.pep.2006.07.023. PMID 16973378.
^ Stone RL, Aimi J, Barshop BA, Jaeken J, Van den Berghe G, Zalkin H, Dixon JE (abril de 1992). "Una mutación en la adenilosuccinato liasa asociada con retraso mental y características autistas". Genética de la Naturaleza . 1 (1): 59–63. doi :10.1038/ng0492-59. PMID 1302001. S2CID 21577926.
^ ab Palenchar JB, Crocco JM, Colman RF (agosto de 2003). "La caracterización de adenilosuccinato liasas mutantes de Bacillus subtilis correspondientes a deficiencias graves de adenilosuccinato liasa humana". Ciencia de las proteínas . 12 (8): 1694–705. doi :10.1110/ps.0303903. PMC 2323956 . PMID 12876319.
^ Jaeken J, Van den Berghe G (noviembre de 1984). "Un síndrome autista infantil caracterizado por la presencia de succinilpurinas en los fluidos corporales". Lanceta . 2 (8411): 1058–61. doi :10.1016/s0140-6736(84)91505-8. PMID 6150139. S2CID 54275991.
^ Maddocks J, Reed T (enero de 1989). "Prueba de orina para detectar deficiencia de adenilosuccinasa en niños autistas". Lanceta . 1 (8630): 158–9. doi :10.1016/S0140-6736(89)91172-0. PMID 2563072. S2CID 1534130.
^ Marshall VM, Coppel RL (septiembre de 1997). "Caracterización del gen que codifica la adenilosuccinato liasa de Plasmodium falciparum". Parasitología Molecular y Bioquímica . 88 (1–2): 237–41. doi :10.1016/S0166-6851(97)00054-6. PMID 9274883.
Otras lecturas
Marie S, Cuppens H, Heuterspreute M, Jaspers M, Tola EZ, Gu XX, Legius E, Vincent MF, Jaeken J, Cassiman JJ, Van den Berghe G (1999). "Análisis de mutaciones en la deficiencia de adenilosuccinato liasa: ocho nuevas mutaciones en la secuencia de codificación ADSL completa reevaluada". Mutación humana . 13 (3): 197–202. doi : 10.1002/(SICI)1098-1004(1999)13:3<197::AID-HUMU3>3.0.CO;2-D . PMID 10090474. S2CID 37296574.
Kmoch S, Hartmannová H, Stibůrková B, Krijt J, Zikánová M, Sebesta I (junio de 2000). "Adenilosuccinato liasa humana (ADSL), clonación y caracterización de ADNc de longitud completa y su isoforma, estructura genética y base molecular para la deficiencia de ADSL en seis pacientes". Genética Molecular Humana . 9 (10): 1501–13. doi : 10.1093/hmg/9.10.1501 . PMID 10888601.
Race V, Marie S, Vincent MF, Van den Berghe G (septiembre de 2000). "Correlaciones genéticas clínicas, bioquímicas y moleculares en la deficiencia de adenilosuccinato liasa". Genética Molecular Humana . 9 (14): 2159–65. doi : 10.1093/hmg/9.14.2159 . PMID 10958654.
Tabucchi A, Carlucci F, Rosi F, Guerranti R, Marinello E (junio de 2001). "Determinación, actividad y papel biológico de la adenilosuccinato liasa en las células sanguíneas". Biomedicina y Farmacoterapia . 55 (5): 277–83. doi :10.1016/s0753-3322(01)00061-0. PMID 11428554.
Marie S, Race V, Nassogne MC, Vincent MF, Van den Berghe G (julio de 2002). "Mutación de un sitio de unión del factor respiratorio nuclear 2 en la región 5 'no traducida del gen ADSL en tres pacientes con deficiencia de adenilosuccinato liasa". Revista Estadounidense de Genética Humana . 71 (1): 14-21. doi :10.1086/341036. PMC 384970 . PMID 12016589.
Castro M, Pérez-Cerdá C, Merinero B, García MJ, Bernar J, Gil Nagel A, Torres J, Bermúdez M, Garavito P, Marie S, Vincent F, Van den Berghe G, Ugarte M (agosto de 2002). "Detección de deficiencia de adenilosuccinato liasa: hallazgos clínicos, bioquímicos y moleculares en cuatro pacientes". Neuropediatría . 33 (4): 186–9. doi :10.1055/s-2002-34493. PMID 12368987. S2CID 20537145.
Palenchar JB, Colman RF (febrero de 2003). "Caracterización de una adenilosuccinato liasa de Bacillus subtilis mutante equivalente a una enzima mutante que se encuentra en la deficiencia de adenilosuccinato liasa humana: la asparagina 276 juega un papel estructural importante". Bioquímica . 42 (7): 1831–41. doi :10.1021/bi020640+. PMID 12590570.
Edery P, Chabrier S, Ceballos-Picot I, Marie S, Vincent MF, Tardieu M (julio de 2003). "Variabilidad intrafamiliar en la expresión fenotípica de la deficiencia de adenilosuccinato liasa: un informe sobre tres pacientes". Revista Estadounidense de Genética Médica , Parte A. 120A (2): 185–90. doi : 10.1002/ajmg.a.20176 . PMID 12833398. S2CID 21114377.
Stone RL, Aimi J, Barshop BA, Jaeken J, Van den Berghe G, Zalkin H, Dixon JE (abril de 1992). "Una mutación en la adenilosuccinato liasa asociada con retraso mental y características autistas". Genética de la Naturaleza . 1 (1): 59–63. doi :10.1038/ng0492-59. PMID 1302001. S2CID 21577926.
Sivendran S, Patterson D, Spiegel E, McGown I, Cowley D, Colman RF (diciembre de 2004). "Dos nuevas adenilosuccinato liasas humanas mutantes (ASL) asociadas con el autismo y caracterización del mutante equivalente Bacillus subtilis ASL". La Revista de Química Biológica . 279 (51): 53789–97. doi : 10.1074/jbc.M409974200 . PMID 15471876.
