La adenilosuccinato liasa forma parte de la superfamilia de enzimas de eliminación β y actúa a través de un mecanismo de reacción E1cb . La enzima es un homotetrámero con tres dominios en cada monómero y cuatro sitios activos por homotetrámero.
Este diagrama de flujo muestra los pasos en la biosíntesis de AMP. Los pasos en verde muestran los pasos catalizados por ASL. Los pasos en rojo muestran la desfosforilación de los sustratos de ASL.
La adenilosuccinato liasa (ASL) es una enzima que cataliza dos reacciones en la vía de biosíntesis de novo de las purinas . En ambas reacciones, utiliza un mecanismo de reacción de eliminación de E1cb para separar el fumarato del sustrato. En la primera reacción, la ASL convierte el 5-aminoimidazol-(N-succinilocarboxamida) ribótido (SAICAR) en 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribótido (AICAR) y fumarato. El AICAR pasa por tres reacciones más antes de convertirse en adenilosuccinato (también llamado succiniladenosina monofosfato o SAMP), que luego la ASL divide en adenosina monofosfato (AMP) y fumarato. [8] La ASL es importante para las células no solo por su participación en la creación de purinas necesarias para la replicación celular , sino también porque ayuda a regular los procesos metabólicos al controlar los niveles de AMP y fumarato en la célula. [9]
El ASL escinde el SAICAR en AICAR y fumarato, y el adenilosuccinato en AMP y fumarato. Esta figura se inspiró en una de un artículo de Toth y Yeates. [5]
Estructura
Subunidades
La adenilosuccinato liasa pertenece a la superfamilia de eliminación β y, como tal, su estructura es un homotetrámero. El monómero de la adenilosuccinato liasa tiene tres dominios. En Thermotoga maritima , el dominio 1 contiene 7 hélices α en los residuos 1-93, incluida la His68, que está altamente conservada y anteriormente se pensaba que era el ácido catalítico en el sitio activo . [5] Estudios más recientes han postulado que la His171 en el dominio 2, que anteriormente se pensaba que era una base catalítica , de hecho puede estar actuando como ácido catalítico, al menos en Escherichia coli . [9] El dominio 2 está formado por los residuos 94-341 y contiene 5 hélices α y la única lámina β del monómero . El dominio 3 está formado por 7 hélices α. El núcleo del tetrámero está formado por las cuatro copias del dominio 2, y hay dos copias de cada uno de los dominios 1 y 3 en cada extremo del tetrámero, lo que le da al tetrámero simetría diedral D2 . El tetrámero tiene cuatro sitios activos, cada uno donde se encuentran tres dominios. [5]
La adenilosuccinato liasa en humanos y Bacillus subtilis puede ser inhibida competitivamente por el sustrato análogo ácido adenosín fosfonobutírico 2'(3'), 5'-difosfato (APBADP). El APBADP es un inhibidor competitivo para ambas reacciones catalizadas por la adenilosuccinato liasa, y los estudios cinéticos con APBADP muestran que los sustratos para ambas reacciones utilizan el mismo sitio activo. [10] En la reacción catalizada por ASL que divide el adenilosuccinato en monofosfato de adenosina (AMP) y fumarato, el AMP debe rotar ligeramente después de que se complete la reacción y antes de que se libere el fumarato para que ambos productos encajen en el sitio activo. [11]
Mutaciones
Los mutantes de adenilosuccinato liasa pueden tener una actividad considerablemente reducida ya sea que la mutación esté dentro o fuera del sitio activo. Los mutantes de ASL causantes de enfermedades R396C y R396H están en la entrada del sitio activo y tienen una Vmax menor que la ASL de tipo salvaje, pero los mutantes K246E y L311V que están lejos del sitio activo también causan una disminución de la Vmax . El mutante de ASL R194C está lejos del sitio activo, y aunque mantiene una Vmax similar a la ASL de tipo salvaje, se demostró que es el menos estable conformacionalmente de los cinco mutantes in vitro y aún causa enfermedad. [12]
Mecanismo
Anteriormente se pensaba que el mecanismo de acción de la adenilosuccinato liasa era una catálisis concertada donde el hidrógeno en el carbono β (con respecto al nitrógeno saliente) era abstraído por la base catalítica al mismo tiempo que el nitrógeno saliente era protonado por el ácido catalítico para la eliminación de E2. [5] Datos más recientes contradicen esta idea y han confirmado que el mecanismo no es de hecho concertado, sino que la abstracción ocurre primero y hay una especie intermedia de carbanión que está estabilizada por resonancia. Para ambas reacciones catalizadas por ASL, la desprotonación del carbono β al nitrógeno saliente ocurre primero, luego ocurre la formación y estabilización por resonancia del carbanión y, por último, la protonación del nitrógeno saliente que hace que se rompa el enlace CN. [9] La confirmación experimental de la desprotonación, la formación de carbanión y el paso limitante de la velocidad de protonación que causa la escisión significa que este es un mecanismo E1cb. Los datos más recientes sugieren que el ácido catalítico es His171, que anteriormente se creía que era la base catalítica, y que, de manera un tanto inusual, es una serina en la posición 295 la que actúa como base catalítica. La escisión del adenilosuccinato a AMP y fumarato es un mecanismo uni-bi ordenado, lo que significa que después de la escisión, el fumarato abandona el sitio activo antes que el AMP. [13]
Mecanismo de acción del ASL. Primero, el ácido desprotona el carbono β, luego se forma un carbanión y se estabiliza por resonancia; por último, el nitrógeno acepta un protón y se rompe el enlace CN. Esta figura se inspiró en un artículo de Tsai et al. [9] NOTA: la estructura del fumarato en esta figura es incorrecta. Debe haber un doble enlace, en configuración trans, entre los átomos de carbono 2 y 3.
Papel en la enfermedad
La adenilosuccinato liasa mutada (ASL) causa una enfermedad clínica en los pacientes que se conoce como deficiencia de adenilosuccinato liasa . Esta afección es rara y se presenta con diversos grados de retraso psicomotor , autismo , atrofia muscular y epilepsia . [14] [15] Se desconoce la causa exacta de la enfermedad, pero las posibilidades incluyen una síntesis insuficiente de nucleótidos de purina para la replicación celular , un mal funcionamiento del ciclo de nucleótidos de purina y una acumulación de sustratos hasta niveles tóxicos. Se han identificado varias mutaciones puntuales vinculadas a la enfermedad, y aquellos que son heterocigotos para una mutación puntual están sanos, pero aquellos que son homocigotos desarrollan una enfermedad clínica. [16] El número de genotipos causantes de enfermedades sigue aumentando a medida que se descubren más mutaciones, y ahora se han identificado treinta mutaciones puntuales diferentes hasta el momento, y una deleción, que causan deficiencia de adenilosuccinato liasa. [17]
Cuando los sustratos de la ASL (adenilosuccinato y SAICAR) se acumulan debido a una deficiencia enzimática, se desfosforilan y se convierten en succiniladenosina (S-Ado) y succinilaminoimidazol carboximida ribósido (SAICA ribósido). [18] Normalmente, estos compuestos no están presentes en el líquido cefalorraquídeo ni en la orina porque la ASL actúa sobre la mayoría de las moléculas de sustrato antes de que puedan acumularse y ser fosforiladas. [15] En el pasado, no existía una buena prueba para la deficiencia de adenilosuccinato liasa, lo que dificultaba el diagnóstico de esta rara enfermedad, pero recientemente se desarrolló una prueba para detectar SAICA y S-Ado en la orina. La prueba es económica y no tuvo falsos positivos ni falsos negativos en la pequeña muestra de los investigadores. [19]
Se cree que el ribósido de SAICA puede ser el compuesto más tóxico, ya que se encuentra en niveles más altos en pacientes con síntomas clínicos graves, y algunos investigadores piensan que el S-Ado puede incluso tener un efecto protector. Es necesario realizar más investigaciones sobre lo que determina la gravedad de la enfermedad, pero la inestabilidad del lenguaje de signos humano en el entorno de laboratorio ha sido un obstáculo para esta investigación. [17]
Aplicaciones terapéuticas
A medida que aumenta la resistencia a los antipalúdicos, los investigadores están buscando nuevas estrategias para atacar a los parásitos Plasmodium que causan la malaria , especialmente el más letal P. falciparum . Algunos investigadores sugirieron que se estudiara el ASL como un posible objetivo farmacológico porque, aunque la interrupción de la vía de biosíntesis de purina de novo es tóxica para el huésped, el ASL de Plasmodium tiene un bajo nivel de homología de secuencia con el ASL humano, lo que puede hacer que cualquier fármaco anti- Plasmodium ASL sea lo suficientemente específico como para no dañar a los huéspedes humanos. [20]
Referencias
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