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ADNG

La DnaG es una primasa de ADN bacteriana y está codificada por el gen dnaG . La enzima DnaG, y cualquier otra primasa de ADN, sintetiza cadenas cortas de ARN conocidas como oligonucleótidos durante la replicación del ADN . Estos oligonucleótidos se conocen como cebadores porque actúan como punto de partida para la síntesis de ADN. La DnaG cataliza la síntesis de oligonucleótidos que tienen entre 10 y 60 nucleótidos (la unidad fundamental del ADN y el ARN) de longitud, sin embargo, la mayoría de los oligonucleótidos sintetizados son de 11 nucleótidos. [1] Estos oligonucleótidos de ARN sirven como cebadores, o puntos de partida, para la síntesis de ADN por la ADN polimerasa III bacteriana (Pol III). La DnaG es importante en la replicación del ADN bacteriano porque la ADN polimerasa no puede iniciar la síntesis de una cadena de ADN, sino que solo puede agregar nucleótidos a una cadena preexistente. [2] La DnaG sintetiza un único cebador de ARN en el origen de la replicación . Este cebador sirve para preparar la síntesis de ADN de la cadena principal . Para la otra cadena parental, la cadena rezagada , DnaG sintetiza un cebador de ARN cada pocas kilobases (kb). Estos cebadores sirven como sustratos para la síntesis de fragmentos de Okazaki . [3]

En E. coli, DnaG se asocia a través de interacciones no covalentes con la helicasa replicativa bacteriana DnaB para realizar su actividad primasa, con tres proteínas primasa DnaG asociándose con cada helicasa DnaB para formar el primosoma . [4] Las primasas tienden a iniciar la síntesis en secuencias específicas de tres nucleótidos en plantillas de ADN monocatenario (ssDNA) y para E. coli DnaG la secuencia es 5'-CTG-3'. [1]

DnaG contiene tres dominios proteicos separados : un dominio de unión de zinc, un dominio de ARN polimerasa y un dominio de unión de helicasa DnaB. Hay varias bacterias que utilizan la ADN primasa DnaG. Algunos organismos que tienen DnaG como su ADN primasa son Escherichia coli ( E. coli ), Bacillus stearothermophilus y Mycobacterium tuberculosis (MTB). La DnaG de E. coli tiene un peso molecular de 60 kilodaltons (kDa) y contiene 581 aminoácidos .

Función

La DnaG (ADN primasa) es una enzima esencial que interviene en la horquilla de replicación del ADN.
Mecanismo orgánico de la síntesis de oligonucleótidos de ácido ribonucleico (ARN) en la dirección 5' a 3'

La DnaG cataliza la síntesis de oligonucleótidos en cinco pasos discretos: unión a la plantilla, unión al nucleósido trifosfato (NTP), iniciación, extensión para formar un cebador y transferencia del cebador a la ADN polimerasa III. [1] La DnaG realiza esta catálisis cerca de la horquilla de replicación que forma la helicasa DnaB durante la replicación del ADN. La DnaG debe formar un complejo con la DnaB para que catalice la formación de los cebadores de oligonucleótidos. [1]

El mecanismo de síntesis de cebadores por parte de las primasas implica dos sitios de unión de NTP en la proteína primasa (DnaG). [5] Antes de la unión de cualquier NTP para formar el cebador de ARN, la secuencia de plantilla de ssDNA se une a DnaG. El ssDNA contiene una secuencia de reconocimiento de tres nucleótidos que recluta a los NTP basándose en el apareamiento de bases de Watson-Crick . [1] Después de unirse al ADN, DnaG debe unirse a dos NTP para generar un complejo cuaternario enzima-ADN-NTP-NTP. Las constantes de Michaelis (km) para los NTP varían según la primasa y las plantillas. [6] Los dos sitios de unión de NTP en DnaG se denominan sitio de iniciación y sitio de elongación. El sitio de iniciación es el sitio en el que se une el NTP que se incorporará en el extremo 5' del cebador. El sitio de elongación une el NTP que se agrega al extremo 3' del cebador.

Una vez que dos nucleótidos se unen a la primasa, DnaG cataliza la formación de un dinucleótido mediante la formación de un enlace fosfodiéster a través de la síntesis por deshidratación entre el hidroxilo 3' del nucleótido en el sitio de iniciación y el α-fosfato del nucleótido en el sitio de elongación. Esta reacción da como resultado un dinucleótido y la ruptura del enlace entre el fósforo α y β, liberando pirofosfato. Esta reacción es irreversible porque el pirofosfato que se forma es hidrolizado en dos moléculas de fosfato inorgánico por la enzima pirofosfatasa inorgánica . [7] Esta reacción de síntesis de dinucleótidos es la misma reacción que cualquier otra enzima que catalice la formación de ADN o ARN ( ADN polimerasa , ARN polimerasa ), por lo tanto, DnaG siempre debe sintetizar oligonucleótidos en la dirección 5' a 3'. En E. coli , los cebadores comienzan con un dinucleótido trifosfato adenina-guanina (pppAG) en el extremo 5'.

Para que se produzca una mayor elongación del dinucleótido, el oligonucleótido debe moverse de modo que el NTP 3' se transfiera desde el sitio de elongación al sitio de iniciación, lo que permite que otro NTP se una al sitio de elongación y se adhiera al hidroxilo 3' del oligonucleótido. Una vez que se ha sintetizado un oligonucleótido de longitud adecuada a partir del paso de elongación de la síntesis del cebador, DnaG transfiere el cebador recién sintetizado a la ADN polimerasa III para que sintetice la cadena líder de ADN o fragmentos de Okazaki para la cadena rezagada. [1] El paso limitante de la velocidad de la síntesis del cebador ocurre después de la unión del NTP pero antes o durante la síntesis del dinucleótido. [6]

Estructura

La primasa DnaG de E. coli es una proteína monomérica de 581 residuos con tres dominios funcionales, según estudios de proteólisis. Hay un dominio de unión de zinc N-terminal (residuos 1-110) donde un ion de zinc está coordinado tetraédricamente entre un residuo de histidina y tres residuos de cisteína, que desempeña un papel en el reconocimiento de sitios de unión de ADN específicos de la secuencia. El dominio central (residuos 111-433) muestra actividades de ARN polimerasa y es el sitio de síntesis de cebadores de ARN. El dominio C-terminal (residuos 434-581) es responsable de la unión no covalente de DnaG a la proteína helicasa DnaB . [8]

Dominio de unión al zinc

Izquierda: Estructura del dominio de unión al cinc de Bacillus stearothermophilus , con los residuos básicos e hidrofóbicos conservados representados en plata. Derecha: Imagen ampliada del sitio de unión al cinc que muestra Cys40, Cys61, Cys64 e His43 coordinando un ion cinc. Diagrama generado a partir de PDB 1D0Q.

El dominio de unión de zinc, el dominio responsable de reconocer sitios de unión de ADN específicos de secuencia, se conserva en todas las primasas de ADN virales, bacteriófagas, procariotas y eucariotas. [9] El dominio de unión de zinc de la primasa es parte de la subfamilia de dominios de unión de zinc conocidos como la cinta de zinc . Los dominios de cinta de zinc se caracterizan por dos bucles de horquilla β que forman el dominio de unión de zinc. Por lo general, se cree que los dominios de cinta de zinc carecen de hélices α , lo que los distingue de otros dominios de unión de zinc. Sin embargo, en 2000, el dominio de unión de zinc de DnaG se cristalizó a partir de Bacillus stearothermophilus, revelando que el dominio consistía en una lámina β antiparalela de cinco hebras adyacente a cuatro hélices α y una hélice 3 10 en el extremo c-terminal del dominio. [9]

El sitio de unión del cinc de B. stearothermophilus consta de tres residuos de cisteína, Cys40, Cys61 y Cys64, y un residuo de histidina, His43. Cys40 e His43 se encuentran en la horquilla β entre la segunda y la tercera lámina β. [9] Cys61 se encuentra en la quinta lámina β, y Cys64 está en la horquilla β entre la cuarta y la quinta lámina β. Estos cuatro residuos coordinan el ion cinc tetraédricamente. Se cree que el ion cinc estabiliza los bucles entre la segunda y la tercera lámina β, así como entre la cuarta y la quinta lámina β. El dominio se estabiliza aún más mediante una serie de interacciones hidrofóbicas entre la superficie interna hidrofóbica de la lámina β que está empaquetada contra la segunda y la tercera hélice α. La superficie externa de la lámina β también tiene muchos residuos básicos e hidrofóbicos conservados. Estos residuos son Lys30, Arg34, Lys46, Pro48, Lys56, Ile58, His60 y Phe62. [9]

Unión del ADN

Se cree que la función del dominio de unión al cinc es el reconocimiento de secuencias específicas de ADN. Las primasas de ADN producen cebadores de ARN que luego se utilizan para la síntesis de ADN. La colocación de los cebadores de ARN no es aleatoria, lo que sugiere que se colocan en secuencias de ADN específicas. De hecho, se ha demostrado que otras primasas de ADN reconocen secuencias de tripletes; la secuencia específica reconocida por B. stearothermophilus aún no se ha identificado. [9] Se ha demostrado que si los residuos de cistina que coordinan el ion cinc están mutados, la primasa de ADN deja de funcionar. Esto indica que el dominio de unión al cinc desempeña un papel en el reconocimiento de secuencias. Además, la superficie hidrófoba de la lámina β, así como los residuos básicos que se agrupan principalmente en un borde de la lámina, sirven para atraer ADN monocatenario, lo que facilita aún más la unión al ADN. [9]

Basándose en estudios previos de unión de ADN por ADN Primasas, se cree que el ADN se une al dominio de unión de zinc a lo largo de la superficie de la lámina β, con los tres nucleótidos uniéndose a lo largo de tres hebras de la lámina β. [9] Los residuos cargados positivamente en la lámina podrían formar contactos con los fosfatos y los residuos aromáticos formarían interacciones de apilamiento con las bases. Este es el modelo de unión de ADN por el dominio de unión de ssDNA de la proteína de replicación A (RPA) . [9] Es lógico suponer que el dominio de unión de zinc de B. stearothermophilus se une al ADN de manera similar, ya que los residuos importantes para la unión del ADN en RPA se encuentran en posiciones estructuralmente equivalentes en B. stearothermophilus . [9]

Dominio de la ARN polimerasa

Estructura del dominio de la ARN polimerasa DnaG de E. coli . Los residuos básicos altamente conservados, Arg146, Arg221 y Lys229, se muestran en amarillo. Esta imagen se obtuvo a partir de PDB 1DD9.

Como sugiere su nombre, el dominio de la ARN polimerasa (RNAP) de DnaG es responsable de sintetizar los cebadores de ARN en el ADN monocatenario. In vivo, DnaG es capaz de sintetizar fragmentos de cebadores de hasta 60 nucleótidos, pero los fragmentos de cebadores in vivo están limitados a aproximadamente 11 nucleótidos. [10] Durante la síntesis de la cadena retrasada, DnaG sintetiza entre 2000 y 3000 cebadores a una velocidad de un cebador por segundo. [10]

El dominio ARN polimerasa de DnaG tiene tres subdominios: el dominio N-terminal, que tiene un pliegue α y β mixto, el dominio central que consta de una lámina β de 5 cadenas y 6 hélices α, y, por último, el dominio C-terminal, que está formado por un haz helicoidal que consta de 3 hélices α antiparalelas. El dominio central está formado en parte por el pliegue toprim , un pliegue que se ha observado en muchas proteínas de fosfotransferencia que se unen a metales. El dominio central y el dominio N-terminal forman una hendidura poco profunda, que constituye el sitio activo de la elongación de la cadena de ARN en DnaG. [10] La abertura de la hendidura está revestida por varios residuos básicos altamente conservados: Arg146, Arg221 y Lys229. Estos residuos son parte de la cresta electrostáticamente positiva del subdominio N-terminal. Esta cresta es la que interactúa con el ssDNA y ayuda a guiarlo hacia la hendidura, que consiste en el centro de unión del metal del motivo toprim en el subdominio central y los motivos primasa conservados del dominio N-terminal. [10] El sitio de unión del metal del dominio toprim es donde se sintetiza el cebador. El dúplex ARN:ADN luego sale a través de otra depresión básica.

Dominio C-Terminal

Estructura del dominio de unión de la helicasa de E. coli . Representada a partir de PDB 2R6A. Las dos hélices inferiores forman la horquilla helicoidal del subdominio C2. Las cinco hélices restantes forman el haz helicoidal del subdominio C1.

A diferencia de los dominios de unión de zinc y los dominios de la ARN polimerasa, los dominios C-terminales de las primasas de ADN no se conservan. En las primasas procariotas, la única función conocida de este dominio es interactuar con la helicasa, DnaB. [1] Por lo tanto, este dominio se llama dominio de unión a la helicasa (HBD). El HBD de DnaG consta de dos subdominios: un haz helicoidal , el subdominio C1, y una horquilla helicoidal, el subdominio C2. [4] [11] Para cada una de las dos o tres moléculas de DnaG que se unen al hexámero DnaB, los subdominios C1 de los HBD interactúan con DnaB en sus dominios N-terminales en la superficie interna del anillo del hexámero, mientras que los subdominios C2 interactúan con los dominios N-terminales en la superficie externa del hexámero.

Bacillus stearothermophilus DnaG, azul, en complejo con el hexámero DnaB, verde. Renderizado de PDB 2R6A

Se han identificado tres residuos en la DnaB de B. stearothermophilus como importantes para la formación de la interfaz DnaB, DnaG. Estos residuos incluyen Tyr88, Ile119 e Ile125. [4] Tyr88 está cerca, pero no hace contacto con el HBD de DnaG. La mutación de Tyr88 inhibe la formación del haz helicoidal del dominio N-terminal de DnaB, interrumpiendo los contactos con el HBD de DnaG. [4] La estructura hexamérica de DnaB es realmente un trímero de dímeros. Tanto Ile119 como Ile125 están enterrados en la interfaz del dímero del dominio N-terminal de DnaB y la mutación de estos residuos inhibe la formación de la estructura hexamérica y, por lo tanto, la interacción con DnaG. [4] Otro residuo que se ha identificado como que desempeña un papel crucial en la interacción de DnaB y DnaG es Glu15. La mutación de Glu15 no altera la formación del complejo DnaB, DnaG, sino que desempeña un papel en la modulación de la longitud de los cebadores sintetizados por DnaG. [4]

Inhibición de DnaG

Análogos de NTP que se sabe que inhiben la DnaG y otras enzimas polimerasas

Los inhibidores de las primasas de ADN son compuestos valiosos para la elucidación de vías bioquímicas e interacciones clave, pero también son de interés como compuestos principales para diseñar fármacos contra enfermedades bacterianas. La mayoría de los compuestos que se sabe que inhiben las primasas son análogos de nucleótidos como AraATP (ver Vidarabine ) y 2-fluoro-AraATP. Estos compuestos a menudo se utilizan como sustratos por la primasa, pero una vez incorporados, la síntesis o elongación ya no puede ocurrir. Por ejemplo, E. coli DnaG utilizará 2',3'-didesoxinucleósido 5'-trifosfatos (ddNTP) como sustratos, que actúan como terminadores de cadena debido a la falta de un hidroxilo 3' para formar un enlace fosfodiéster con el siguiente nucleótido. [1]

El número relativamente pequeño de inhibidores de la primasa probablemente refleja la dificultad inherente de los ensayos de primasa en lugar de una falta de sitios de unión potenciales en la enzima. La corta longitud de los productos sintetizados y la velocidad generalmente lenta de la enzima en comparación con otras enzimas de replicación dificultan el desarrollo de enfoques de detección de alto rendimiento (HTS). [6] A pesar de las dificultades, existen varios inhibidores conocidos de DnaG que no son análogos de NTP. La doxorrubicina y la suramina son inhibidores competitivos de ADN y NTP de DnaG de Mycobacterium Tuberculosis . [12] También se sabe que la suramina inhibe la primasa de ADN eucariota al competir con GTP, por lo que es probable que la suramina inhiba DnaG a través de un mecanismo similar. [1]

Enlaces externos

Referencias

  1. ^ abcdefghi Frick DN, Richardson CC (2001). "ADN primasa". Revisión anual de bioquímica . 70 : 39–80. doi :10.1146/annurev.biochem.70.1.39. PMID  11395402. S2CID  33197061.
  2. ^ Russell P (2009). iGenetics: un enfoque molecular (3.ª ed.). Benjamin Cummings. págs. 42-43. ISBN 978-0321772886.
  3. ^ Nelson D, Cox M (2008). Principios de bioquímica de Lehninger (5.ª ed.). Nueva York: WH Freeman and Company. pp. 986–989. ISBN 978-0716771081.
  4. ^ abcdef Bailey S, Eliason WK, Steitz TA (19 de octubre de 2007). "Estructura de la helicasa hexamérica DnaB y su complejo con un dominio de primasa DnaG". Science . 318 (5849): 459–63. Bibcode :2007Sci...318..459B. doi : 10.1126/science.1147353 . PMID  17947583.
  5. ^ Frick DN, Kumar S, Richardson CC (10 de diciembre de 1999). "Interacción de los trifosfatos de ribonucleósido con el gen 4 primasa del bacteriófago T7". Journal of Biological Chemistry . 274 (50): 35899–907. doi : 10.1074/jbc.274.50.35899 . PMID  10585475.
  6. ^ abc Kuchta RD, Stengel G (mayo de 2010). "Mecanismo y evolución de las primasas de ADN". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteínas y proteómica . 1804 (5): 1180–9. doi :10.1016/j.bbapap.2009.06.011. PMC 2846230. PMID  19540940 . 
  7. ^ Bruice PY (2007). Química orgánica (5.ª ed.). Pearson Education, Inc., págs. 1202-1203. ISBN 978-0-13-199631-1.
  8. ^ Voet, Donald (2010). Bioquímica (4ª ed.). Nueva York: J. Wiley & Sons. pag. 1189.ISBN 978-0-470-57095-1.
  9. ^ abcdefghi Pan H, Wigley DB (15 de marzo de 2000). "Estructura del dominio de unión al zinc de la primasa de ADN de Bacillus stearothermophilus". Estructura . 8 (3): 231–9. doi : 10.1016/S0969-2126(00)00101-5 . PMID  10745010.
  10. ^ abcd Keck JA, Roche DD, Lynch AS, Berger JM (31 de marzo de 2000). "Estructura del dominio de la ARN polimerasa de la primasa de E. coli". Science . 287 (5462): 2482–6. Bibcode :2000Sci...287.2482K. doi :10.1126/science.287.5462.2482. PMID  10741967. S2CID  27005599.
  11. ^ Oakley AJ, Loscha KV, Schaeffer PM, Liepinsh E, Pintacuda G, Wilce MCJ, Otting G, Dixon NE (15 de enero de 2005). "Estructuras cristalinas y en solución del dominio de unión a la helicasa de la primasa de Escherichia coli". The Journal of Biological Chemistry . 280 (12): 11495–11504. doi : 10.1074/jbc.M412645200 . PMID  15649896.
  12. ^ Biswas T, Resto-Roldan E, Sawyer SK, Artsimovitch I, Tsodikov OV (diciembre de 2012). "Un nuevo ensayo de actividad de pirofosfatasa primasa no radiactiva y su aplicación al descubrimiento de inhibidores de la DnaG de la primasa de Mycobacterium tuberculosis". Nucleic Acids Research . 41 (4): e56. doi :10.1093/nar/gks1292. PMC 3575809 . PMID  23267008.