La toxina del cólera (también conocida como colerágeno y a veces abreviada como CTX , Ctx o CT ) es un complejo proteico multimérico AB5 secretado por la bacteria Vibrio cholerae . [1] [2] CTX es responsable de la diarrea acuosa masiva característica de la infección por cólera . [3] Es un miembro de la familia de las enterotoxinas termolábiles .
Robert Koch , médico y microbiólogo alemán, fue la primera persona en postular la existencia de la toxina del cólera. En 1886, Koch propuso que Vibrio cholerae secretaba una sustancia que causaba los síntomas del cólera . [4] La postulación de Koch fue demostrada correcta por el microbiólogo indio Sambhu Nath De , quien en 1951 estudió y documentó los efectos de inyectar a conejos bacterias del cólera muertas por calor. [5] De concluyó de este experimento que una endotoxina liberada tras la desintegración de la bacteria era la causa de los síntomas del cólera. [5] En 1959, De llevó a cabo otro experimento, esta vez utilizando un filtrado de cultivo libre de bacterias de V. Cholera inyectado en el intestino delgado de conejos. [6] La acumulación resultante de líquido en los intestinos demostró de manera concluyente la existencia de una toxina. [7]
La toxina completa es un hexámero formado por una única copia de la subunidad A (parte A, enzimática, P01555 ) y cinco copias de la subunidad B (parte B, de unión al receptor, P01556 ), denominada AB 5 . La subunidad B se une mientras que la subunidad A activa la proteína G que activa la adenilato ciclasa . La estructura tridimensional de la toxina fue determinada mediante cristalografía de rayos X por Zhang et al. en 1995. [8]
Las cinco subunidades B, cada una de las cuales pesa 11 kDa , forman un anillo de cinco miembros. La subunidad A, que tiene 28 kDa, tiene dos segmentos importantes. La porción A1 de la cadena (CTA1) es una carga útil de enzima globular que el ADP ribosila las proteínas G , mientras que la cadena A2 (CTA2) forma una hélice alfa extendida que se asienta cómodamente en el poro central del anillo de la subunidad B. [9]
Esta estructura es similar en forma, mecanismo y secuencia a la enterotoxina termolábil secretada por algunas cepas de la bacteria Escherichia coli .
La toxina del cólera actúa mediante el siguiente mecanismo: primero, el anillo de la subunidad B de la toxina del cólera se une a los gangliósidos GM1 en la superficie de las células diana. Si una célula carece de GM1, lo más probable es que la toxina se una a otros tipos de glicanos , como Lewis Y y Lewis X , unidos a proteínas en lugar de lípidos. [10] [11] [12] Una vez unido, todo el complejo de toxina es endocitado por la célula y la reducción de un puente disulfuro libera la cadena de la toxina A1 del cólera (CTA1). El endosoma se traslada al aparato de Golgi , donde la proteína A1 es reconocida por la chaperona del retículo endoplásmico (RE) , la proteína disulfuro isomerasa . Luego, la cadena A1 se despliega y se entrega a la membrana, donde Ero1 desencadena la liberación de la proteína A1 mediante la oxidación del complejo de proteína disulfuro isomerasa. [13] A medida que la proteína A1 se mueve desde el RE hacia el citoplasma por el canal Sec61 , se repliega y evita la desactivación como resultado de la ubiquitinación .
Luego, CTA1 queda libre para unirse con una proteína asociada humana llamada ARF6 (factor de ribosilación de ADP 6); La unión a Arf6 provoca un cambio en la forma de CTA1 que expone su sitio activo y permite su actividad catalítica. [14] El fragmento CTA1 cataliza la ribosilación de ADP de las proteínas de la subunidad alfa Gs (Gαs ) utilizando NAD . La ribosilación de ADP hace que la subunidad Gαs pierda su actividad catalítica de hidrólisis de GTP en GDP + Pi , manteniendo así a Gαs en su estado activado. El aumento de la activación de Gα conduce a un aumento de la actividad de la adenilato ciclasa , lo que aumenta la concentración intracelular de AMP 3',5'-cíclico (AMPc) a más de 100 veces por encima de lo normal y sobreactiva la PKA citosólica . Estas PKA activas luego fosforilan las proteínas del canal de cloruro reguladoras de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) , lo que conduce a una salida de iones cloruro mediada por ATP y conduce a la secreción de H 2 O , Na + , K + y HCO 3 − hacia el intestino. luz . Además, se disminuye la entrada de Na + y consecuentemente la entrada de agua al interior de los enterocitos . Los efectos combinados dan como resultado una rápida pérdida de líquido del intestino, hasta 2 litros por hora, lo que provoca una deshidratación grave y otros factores asociados con el cólera, incluidas las heces de agua de arroz . [15]
La toxina pertussis (también una proteína AB 5 ) producida por Bordetella pertussis actúa de manera similar con la excepción de que ADP-ribosila la subunidad Gα i , haciéndola incapaz de inhibir la producción de AMPc. [dieciséis]
El gen que codifica la toxina del cólera se introdujo en V. cholerae mediante transferencia genética horizontal . Las cepas virulentas de V. cholerae (los serogrupos O1 y O139 ) contienen genes de un virus conocido como bacteriófago CTXφ . [17] El gen CTXφ integrado contiene muchos de los genes de RS1, un fago "satélite" filamentoso, que incluye elementos para la replicación (RstA), la integración (RstB) y la regulación de la expresión génica (RstR), así como genes que codifican para proteínas necesarias para el empaquetamiento y la secreción de los fagos (Psh, Cep, OrfU, Ace y Zot), que son muy similares a los genes de los colifagos filamentosos Ff. [17] Estos genes (y otros) permiten la replicación y posterior secreción del bacteriófago CTXφ, así como la codificación de CTX, lo que permite la transferencia horizontal del gen CTXφ a otras células susceptibles. [17]
Debido a que la subunidad B parece ser relativamente no tóxica, los investigadores le han encontrado varias aplicaciones en biología celular y molecular. Se utiliza habitualmente como trazador neuronal . [18]
El tratamiento de células madre neurales de roedores cultivadas con toxina del cólera induce cambios en la localización del factor de transcripción Hes3 y aumenta su número. [19]
Los gangliósidos GM1 se encuentran en balsas de lípidos en la superficie celular. Para identificar balsas se pueden utilizar complejos de subunidad B marcados con etiquetas fluorescentes o posteriormente dirigidos con anticuerpos.
Actualmente existen dos vacunas contra el cólera: Dukoral y Shanchol. Ambas vacunas utilizan células enteras muertas de V. cholerae; sin embargo, Dukoral también contiene la toxina β del cólera recombinante (rCTB). Algunos estudios sugieren que la inclusión de rCTB puede mejorar la eficacia de la vacuna en niños pequeños (2-10) y aumentar la duración de la protección. Esto se contrarresta con los costos de proteger y almacenar rCTB contra la degradación. [20]
Otra aplicación de la subunidad CTB puede ser como adyuvante de otras vacunas. Se ha demostrado que el acoplamiento de CTB y antígenos mejora la respuesta de la vacuna. Actualmente, el potencial adyuvante de la CTB se ha demostrado en modelos animales grandes, por lo que se necesita más investigación. Esto puede permitir que CTB se utilice como adyuvante en la vacunación contra muchos tipos de enfermedades. Esto puede incluir infecciones bacterianas y virales, alergias y diabetes. Es de destacar que, como se ha demostrado que la CTB induce respuestas inmunitarias humorales de las mucosas , las vacunas contra virus de las mucosas como el VIH son un objetivo potencial. [20]
Dado que se ha demostrado que la toxina del cólera se une preferentemente a los gangliósidos GM1, esta característica puede utilizarse para estudios de membrana. Las balsas de lípidos son difíciles de estudiar ya que varían en tamaño y vida útil, además de ser parte de un componente extremadamente dinámico de las células. Utilizando la toxina β del cólera como marcador, podemos comprender mejor las propiedades y funciones de las balsas lipídicas. [21]
La endocitosis se divide en términos generales en proceso dependiente de clatrina e independiente de clatrina, y la toxina del cólera utiliza ambas vías. Se ha demostrado que la toxina del cólera ingresa a las células mediante endocitosis por múltiples vías. Estas vías incluyen caveolas , fosas recubiertas de clatrina, portadores independientes de clatrina (CLIC) y la vía de los compartimentos endocíticos enriquecidos con GPI (GEEC), la endocitosis mediada por ARF6 y la endocitosis rápida mediada por endofilina (FEME). No se comprende completamente cómo la toxina del cólera desencadena estas vías de endocitosis, pero el hecho de que la toxina del cólera desencadene estas vías muestra el uso de la toxina como un marcador importante para investigar estos mecanismos. [21]
Uno de los aspectos más importantes de la toxina del cólera es el mecanismo de tráfico retrógrado que transporta la toxina desde la membrana celular de regreso a la red trans-Golgi y al retículo endoplásmico. Dado que tanto la toxina del cólera como las especies GM1 pueden marcarse con etiquetas fluorescentes, se puede monitorear el mecanismo del tráfico retrógrado. Esto abre la posibilidad de monitorear el mecanismo en tiempo real. Esto puede abrir nuevos descubrimientos sobre cómo funciona el transporte intracelular y cómo funciona la clasificación de proteínas y lípidos en la vía endocitotica . [21]