La kalkitoxina , una toxina derivada de la cianobacteria Lyngbya majuscula , induce necrosis neuronal mediada por el receptor NMDA , bloquea los canales de sodio dependientes de voltaje e induce hipoxia celular al inhibir el complejo 1 de la cadena de transporte de electrones (CTE).
La kalkitoxina es una ictiotoxina derivada de la cianobacteria Lyngbya majuscula [1] que cubre secciones del arrecife de coral. [2] Normalmente forma minifloraciones [2] y produce varios metabolitos, como kalkitoxina, curacina-A y antillatoxina . [1] La kalkitoxina se ha encontrado y purificado cerca de las costas de Curazao [1] y Puerto Rico. [3]
La kalkitoxina es una toxina lipopeptídica [4] con un peso molecular de 366,604 Da. [5] Su fórmula química es C 21 H 38 N 2 OS. [6] La estructura contiene dos enlaces dobles, un sistema de anillo de tiazolina 2,4-disustituido y un grupo carbonilo adicional. [6] Cada uno de estos cuatro grupos proporciona un grado de insaturación, lo que hace que la kalkitoxina tenga cuatro grados de insaturación . [6] La estructura contiene 5 centros quirales , uno de los cuales se debe a un sustituyente del anillo de tiazolina, y los otros cuatro se deben a grupos metino a lo largo de la cadena de carbono alifático , [7] que son átomos de carbono terciarios que tienen tres enlaces de carbono simples y un hidrógeno. Los cuatro grupos metilo (cada uno en un centro quiral metino), la estereoquímica general de la estructura y el grupo N-metilo contribuyen a la toxicidad de la kalkitoxina. [7]
La estructura de la kalkitoxina se determinó primero caracterizando seis estructuras parciales que posteriormente se conectaron para producir la estructura total. [4] Esta investigación se llevó a cabo en gran parte a través de varios experimentos de RMN . La estructura (a) es un grupo sec-butilo , indicado por el desprotector característico de su grupo metino central debido al carbonilo adyacente . La estructura (b) contiene este grupo carbonilo y un átomo de nitrógeno metilado terciario adyacente, que constituye un grupo amida terciaria . Dado que se trata de una amida terciaria, existe en una mezcla cis/trans, que subyace a las dos conformaciones de la kalkitoxina. La estructura (c) es una cadena de dos grupos metileno , luego un grupo metino que lleva un grupo metilo de alto campo. Los siguientes dos grupos identificados (d, e) son cadenas idénticas y opuestas de CH2-CH-CH3, sin embargo, los protones de metileno del grupo de la izquierda experimentan un mayor desprotector , debido a su proximidad a la imina adyacente . El desprotección es un efecto en el que un átomo electronegativo cercano retira densidad de electrones de un núcleo atómico determinado, lo que provoca un mayor desplazamiento químico medido por RMN.
La estructura parcial final consiste en un anillo de tiazolina con un sustituyente alqueno terminal , según lo determinado por espectrometría de masas de ionización electrónica (EI-MS) y RMN de 13 C. [4] Los desplazamientos químicos de los carbonos del anillo adyacentes a los heteroátomos de azufre y nitrógeno se compararon con los datos de RMN de 13 C de compuestos modelo. Esto permitió la determinación de las ubicaciones de estos heteroátomos en el anillo y, posteriormente, la existencia del propio anillo de tiazolina. [8] Con estas estructuras parciales establecidas, se evaluó su conectividad mediante espectroscopia HMBC , [4] una técnica de RMN 2D que permite la determinación de valores de acoplamiento J heteronuclear para carbonos y protones no adyacentes. Esto permite determinar la relación espacial de átomos de carbono e hidrógeno específicos dentro de una estructura.
La kalkitoxina tiene cinco centros quirales , uno de los cuales es el carbono del anillo al que está coordinado el alqueno terminal , y los cuatro restantes se encuentran en los átomos de carbono terciarios a lo largo de la cadena alifática que se origina a partir del nitrógeno imino . La estereoquímica total de la (+)-kalkitoxina natural es 3R,7R,8S,10S,2′R. [6] Para esta determinación, se obtuvieron valores de 3 J CH mediante una variación de la técnica de pulso HSQMBC, un tipo de espectroscopia HMBC , y valores de 3 J HH mediante espectroscopia de correlación exclusiva (E.COSY). Estos métodos utilizan RMN para evaluar las constantes de acoplamiento espín-espín que se relacionan directamente con el ángulo diedro de los átomos que se analizan, lo que permite la determinación de la quiralidad. Esto se utilizó para determinar la estereoquímica de los centros quirales en C7, C8 y C10. Debido a que C7 y C8 son estereocentros adyacentes, estas técnicas permitieron la determinación inmediata de su estereoquímica relativa, sin embargo C10 está separado de C8 por C9, que lleva dos protones diastereotópicos . Esto permite la determinación de la estereoquímica relativa de C8 y C10 a los protones C9 a través de valores de [[acoplamiento J \ acoplamiento 3 J]], para relacionar la estereoquímica relativa de C8 a C10. Estos métodos produjeron una estereoquímica relativa de 7R, 8S, 10S para los estereocentros de la cadena alifática. [6] La estereoquímica en C3 se determinó mediante el análisis de Marfey, en el que el compuesto se ozonizó y posteriormente se hidrolizó para obtener ácido cisteico a partir del anillo de tiazolina y el alqueno terminal unido. El análisis de Marfey indicó que este derivado de aminoácido era ácido L-cisteico, lo que indica una estereoquímica absoluta de R en C3. [6] La estereoquímica absoluta de la molécula total se determinó sintetizando las posibles configuraciones de las quiralidades relativas ya determinadas y comparándolas con la kalkitoxina natural a través de diferencias de desplazamiento de RMN de 13 C , revelando que la estereoquímica natural de la (+)-kalkitoxina es 3R,7R,8S,10S,2′R. [6]
La relación estructura-actividad (SAR) de una molécula es la conexión entre las fracciones estructurales dentro del compuesto y cómo esas estructuras específicas contribuyen directamente al alcance y carácter de la actividad biológica de la molécula . La kalkitoxina exhibe una potente citotoxicidad que depende del anillo de tiazolina completo para su acción. [9] Los análogos de kalkitoxina que carecen del anillo de tiazolina completo exhiben una toxicidad del orden de 1000 veces menor para las líneas celulares de tumores sólidos. [9] Esto indica que la estructura del anillo de tiazolina es un componente crucial del mecanismo de citotoxicidad de la kalkitoxina. La necesidad de la estereoquímica exhibida en la (+)-kalkitoxina natural disminuye al moverse hacia los centros quirales en el núcleo de la molécula, mientras que los centros quirales más terminales y el grupo metilo amida son cada vez más cruciales para la toxicidad. [7] En un estudio que analizó la toxicidad de la kalkitoxina y varios análogos contra el camarón de salmuera, los análogos que experimentaron la pérdida de potencia menos significativa fueron los epímeros en C8 o C10. [7] Esto indica que las quiralidades C8 y C10 en la (+)-kalkitoxina natural son las menos críticas para la actividad biológica tóxica. Es evidente que la quiralidad C10 es menos crítica que C8, porque el epímero de la (+)-kalkitoxina en C10 es más potente que el epímero en C8. [7] Además, la eliminación del grupo metilo C10 tiene un impacto menor en la potencia que la epimerización de C7, lo que respalda la tendencia de una menor correlación SAR en los centros quirales centrales de la cadena alifática. [7] La epimerización en C3, el punto de unión del alqueno terminal al anillo de tiazolina, disminuye aún más la potencia de la kalkitoxina, de acuerdo con el anillo de tiazolina y la conformación general del segmento más a la izquierda de la molécula que es crítico para la bioactividad. Finalmente, el reemplazo de la amida terciaria con una amida secundaria elimina cualquier toxicidad observable, por lo que esta estructura es crucial en el mecanismo de toxicidad de la kalkitoxina. [7]
Este esfuerzo fue la primera síntesis total de (+)-kalkitoxina, y sirvió al propósito de deducir la estereoquímica específica de la kalkitoxina natural. [6] Esta síntesis comenzó a partir de un alcohol que tenía la quiralidad adecuada en C8 y C10 que se encuentra en (+)-kalkitoxina, y llevaba un grupo dimetilfenilsiloxi (DPSO) posicionado beta a C8, y un alqueno terminal posicionado alfa a C10. La hidroboración de este alqueno da el alcohol resultante, que se convierte en una azida , que es la posición en la que el ácido (R)-2-metilbutírico se acopla para producir el grupo sec-butilo y el grupo amida . La amida se metila posteriormente , finalizando la amida terciaria que se ha demostrado que es tan crucial para la toxicidad de la kalkitoxina. [7] La O-desililación y oxidación del alcohol resultante produce un aceptor para una reacción de Horner-Wadsworth-Emmons , en la que un carbonilo y un fosfonato alfa- metilado reaccionan para producir un alqueno. En este caso, un beta-cetofosfonato que lleva un grupo auxiliar derivado de (R) -fenilglicina se ligó a la molécula. Este grupo se pierde en la adición conjugada asimétrica de un (R)-aminoalcohol, que, a través de dos pasos de ciclodeshidratación utilizando el protocolo de interconversión de oxazolina-tiazolina de Wipf, produce el anillo de tiazolina. [6]
La segunda síntesis total de (+)-kalkitoxina fue de solo 16 pasos y dio un rendimiento general del 3% . [10] Un aspecto importante por el cual esto difiere de la primera síntesis total de (+)-kalkitoxina es que en lugar de usar una reacción de Horner-Wadsworth-Emmons para ligar un fosfonato que lleva la 4-fenil-2-oxazolidinona, se usó en su lugar una reacción de adición conjugada de organocobre . [10] Esto se hizo específicamente conectando las especies de organocobre a una 4-fenil-2-oxazolidinona que lleva un grupo (S)-N-trans- crotonilo a través de una adición nucleofílica 1,4- a la α,β-insaturación del grupo crotonilo. Este método es ventajoso porque permite la estereoselectividad de la configuración 1,3-dimetil resultante durante la introducción secuencial más grande de los sustituyentes de metilo en los centros quirales C7, C8 y C10.
Otro punto de divergencia entre estas dos síntesis es el número de carbonos que separan al grupo auxiliar ceto del centro quiral en C7. Este grupo fue separado por un carbono de C7 en la primera síntesis total, por lo que la fracción ceto-auxiliar se pudo convertir en un ácido carboxílico , en previsión de la adición del aminoalcohol inmediatamente después. [6] En esta síntesis, este grupo auxiliar ceto es directamente adyacente a C7, lo que requiere una homologación de un carbono, antes de la construcción del anillo de tiazolina. Esto se logró a través de la escisión del enlace reductor del grupo auxiliar a un alcohol primario y la oxidación al aldehído correspondiente, la reacción de Wittig utilizando un iluro que lleva un grupo metoxi para producir un éter enólico , hidrólisis al aldehído y finalmente oxidación para producir el ácido carboxílico. [10]
Esta síntesis se diferencia en que adopta un enfoque de síntesis de " cadena de montaje ", a diferencia del enfoque sintético iterativo convencional adoptado en síntesis anteriores que normalmente requieren interconversiones de grupos funcionales y purificaciones repetitivas para extensiones de cadena alifática , como la que se encuentra en la kalkitoxina. Este nuevo enfoque se logra mediante el uso de la extensión de cadena controlada por reactivo de un éster borónico, [11] que se basa en una migración espontánea de 1,2 después de la formación de un compuesto intermedio que incorpora un bloque de construcción de éster de benzoato litiado recién agregado . [12]
Esto permite controlar la quiralidad en cada adición seleccionando la quiralidad de cada éster de benzoato añadido. Además, esto evita los pasos repetitivos de interconversión y purificación que normalmente se requieren para las extensiones de cadena repetidas, lo que aumenta el rendimiento y la eficiencia y reduce la mano de obra. Esta síntesis aprovechó esta técnica al producir la cadena alifática central como un único fragmento grande, y acopló este fragmento al grupo sec-butilo quiral que porta un ácido carboxílico. [12] El fragmento de amino tioéter opuesto se sintetizó por separado, y luego se adjuntó y posteriormente se cicló siguiendo el procedimiento ideado por White et al. [10] En total, esta síntesis requiere solo 7 pasos si la serie de homologación inicial se cuenta como un paso. [12]
Publicado en Nature: Burns, M., Essafi, S., Bame, J. et al. Síntesis en cadena de montaje de moléculas orgánicas con formas personalizadas. Nature 513, 183–188 (2014). https://doi.org/10.1038/nature13711
La kalkitoxina puede activar el receptor NMDA . [1] También bloquea el canal de sodio dependiente de voltaje [13] y el complejo 1 de la cadena de transporte de electrones (CTE) . [13] Sigue sin conocerse exactamente cómo se une la kalkitoxina al canal de sodio dependiente de voltaje. Se han descartado los sitios de unión 1 y 2 de la neurotoxina, mientras que se sugiere el sitio 7 de la neurotoxina como sitio de unión para la kalkitoxina. [4] Esto es probable, porque hay inhibición del canal por la kalkitoxina cuando está presente la deltametrina, que tiene efectos alostéricos positivos. [13] Esto podría deberse a que los determinantes moleculares para la unión son similares en la kalkitoxina y la deltametrina. [13]
La kalkitoxina induce necrosis neuronal retardada en las células granulares del cerebelo de la rata. [1] Esta necrosis neuronal resultó estar mediada por el receptor NMDA . [1] Estos receptores normalmente son activados por el glutamato y otros compuestos excitotóxicos y pueden inducir necrosis neuronal. [1] Aún no se sabe si la toxina induce necrosis directamente o a través de la liberación de compuestos excitotóxicos. [1]
En segundo lugar, la kalkitoxina bloquea los canales de sodio dependientes del voltaje , inhibiendo así la liberación de Ca 2+ que normalmente ocurre cuando se activa el canal de sodio dependiente del voltaje, en una cuestión dependiente de la concentración. [13] Se ha demostrado que la liberación de calcio induce la producción de lactato deshidrogenasa (LDH). [13] La cantidad de LDH es una medida de la muerte celular neuronal. [13] En presencia de kalkitoxina también hay una inhibición dependiente de la concentración de la muerte celular neuronal y la producción de LDH (9). El mecanismo detrás de esta inhibición aún se desconoce. [13]
En tercer lugar, la kalkitoxina bloquea el complejo 1 de la cadena de transporte de electrones (ETC), [2] uno de los complejos proteicos implicados en la respiración mitocondrial. [2] Al bloquear el complejo 1 de la ETC, la kalkitoxina inhibe potentemente la activación del factor inducible por hipoxia -1 (HIF-1). [2] El HIF-1 es un factor de transcripción que mejora la expresión de genes que aumentan la disponibilidad de oxígeno, así como de genes que disminuyen el consumo de oxígeno. [2] La inhibición del HIF-1, que es uno de los principales efectos de la kalkitoxina, induce hipoxia celular.
La kalkitoxina es ictiotóxica para los peces dorados ( Carassius auratus , LC 50 : 700 nM) y para los crustáceos acuáticos ( Artemia salina , LC 50 : 150-180 nM [7] ). [14] También se ha demostrado que la kalkitoxina tiene efectos neurotóxicos retardados en las células granulares cerebelosas de la rata (LC 50 : 3,86 nM). [2]
Muchos esfuerzos para descubrir fármacos terapéuticos contra el cáncer se centran en la selección de nuevas biomoléculas producidas y aisladas de varias plantas y animales. [15] Estas moléculas aisladas se seleccionan mediante ensayos in vitro para medir sus efectos en paradigmas estandarizados diseñados para seleccionar el efecto terapéutico deseado. La kalkitoxina se aisló originalmente de Lyngbya majuscula como un esfuerzo por recolectar nuevas moléculas para probar como agentes antitumorales o antifúngicos. [4] Una de las primeras pruebas de citotoxicidad selectiva de tumores de la kalkitoxina utilizó un ensayo in vitro para probar la selectividad de tumores sólidos de la citotoxicidad previamente demostrada de la kalkitoxina contra la línea celular de colon humano HCT-116. [9] El ensayo midió el grado de citotoxicidad diferencial de la kalkitoxina y varias estructuras análogas observando la citotoxicidad diferencial contra células tumorales sólidas y células tumorales no sólidas, como células leucémicas o células normales. Esta prueba arrojó resultados prometedores, ya que la kalkitoxina exhibió una citotoxicidad preferencial para las condiciones de prueba de células tumorales sólidas (células Colon 38 y HCT-116) en comparación con las condiciones de células normales y tumorales no sólidas. [9]
La kalkitoxina ejerce este efecto citotóxico a través de la inhibición del complejo 1 de la cadena de transporte de electrones mitocondrial . [2] Esto provoca la inhibición de la activación de HIF-1 inducida por hipoxia , que es crucial en los cánceres de tumores sólidos porque la hipoxia impulsa la angiogénesis tumoral , lo que lleva a un empeoramiento de las etapas de la enfermedad y una mayor resistencia al tratamiento. HIF-1 es un factor de transcripción que induce la expresión de genes que promueven la disponibilidad de oxígeno y disminuyen el consumo de oxígeno, cuyo efecto contrarresta la hipoxia celular . [16] Por lo tanto, la capacidad inhibidora de HIF-1 de la kalkitoxina la posiciona como una molécula potencialmente prometedora para contrarrestar la progresión de algunos cánceres de tumores sólidos al bloquear la respuesta proliferativa del tumor a la hipoxia. La salvedad de las prometedoras propiedades antiproliferativas de la kalkitoxina son sus efectos neurotóxicos. En concentraciones comparables a las requeridas para la citotoxicidad selectiva del tumor, la kalkitoxina induce la muerte celular cuando se aplica a las neuronas granulares cerebelosas (CGN) de rata en cultivo. [2] La kalkitoxina actúa como un agonista del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) e induce citotoxicidad en CGN de rata cultivadas en puntos temporales retardados. [1] Por lo tanto, este efecto debe tenerse en cuenta al considerar la kalkitoxina o sus derivados químicos para su uso como una opción terapéutica.
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