En microscopía óptica , la inmersión en aceite es una técnica utilizada para aumentar el poder de resolución de un microscopio . Esto se logra sumergiendo tanto la lente objetivo como la muestra en un aceite transparente de alto índice de refracción , aumentando así la apertura numérica de la lente objetivo.
Sin aceite, las ondas de luz se reflejan en la muestra del portaobjetos a través del cubreobjetos de vidrio, a través del aire y dentro de la lente del microscopio (consulte la figura en color a la derecha). A menos que una onda salga en un ángulo de 90 grados, se dobla cuando golpea una nueva sustancia, y la cantidad de curvatura depende del ángulo. Esto distorsiona la imagen. El aire tiene un índice de refracción muy diferente al del vidrio, lo que provoca una curvatura mayor en comparación con el aceite, que tiene un índice más similar al del vidrio. El aceite especialmente fabricado puede tener casi exactamente el mismo índice de refracción que el vidrio, lo que hace que una lente sumergida en aceite sea casi tan efectiva como tener una muestra enteramente de vidrio (lo cual no sería práctico).
Los aceites de inmersión son aceites transparentes que tienen características ópticas y de viscosidad específicas necesarias para su uso en microscopía. Los aceites típicos utilizados tienen un índice de refracción de alrededor de 1,515. [1] Un objetivo de inmersión en aceite es una lente objetiva especialmente diseñada para usarse de esta manera. Muchos condensadores también ofrecen una resolución óptima cuando la lente del condensador se sumerge en aceite.
Las lentes reconstruyen la luz dispersada por un objeto. Para lograr este fin con éxito, lo ideal es que se recopilen todas las órdenes de difracción. Esto está relacionado con el ángulo de apertura de la lente y su índice de refracción. La resolución de un microscopio se define como la separación mínima necesaria entre dos objetos examinados para que el microscopio los distinga como objetos separados. Esta distancia mínima está etiquetada como δ. Si dos objetos están separados por una distancia menor que δ, aparecerán como un solo objeto en el microscopio.
Una medida del poder de resolución, RP, de una lente viene dada por su apertura numérica , NA:
donde λ es la longitud de onda de la luz. De esto se desprende claramente que una buena resolución (pequeño δ) está asociada a una alta apertura numérica.
La apertura numérica de una lente se define como
donde α 0 es la mitad del ángulo que abarca la lente del objetivo vista desde la muestra, y n es el índice de refracción del medio entre la lente y la muestra (≈1 para el aire).
Los objetivos de última generación pueden tener una apertura numérica de hasta 0,95. Debido a que el sen α 0 es siempre menor o igual a la unidad (el número "1"), la apertura numérica nunca puede ser mayor que la unidad para un objetivo en el aire. Sin embargo, si el espacio entre la lente del objetivo y la muestra se llena con aceite, la apertura numérica puede obtener valores superiores a la unidad. Esto se debe a que el petróleo tiene un índice de refracción superior a 1.
De lo anterior se entiende que el aceite entre la muestra y la lente del objetivo mejora el poder de resolución en un factor 1/ n . Los objetivos diseñados específicamente para este fin se conocen como objetivos de inmersión en aceite.
Los objetivos de inmersión en aceite se utilizan sólo con aumentos muy grandes que requieren un alto poder de resolución. Los objetivos con gran poder de aumento tienen distancias focales cortas , lo que facilita el uso del aceite. Se aplica el aceite a la muestra (microscopio convencional) y se eleva la platina sumergiendo el objetivo en aceite. (En los microscopios invertidos el aceite se aplica al objetivo).
Los índices de refracción del aceite y del vidrio en el primer elemento de la lente son casi los mismos, lo que significa que la refracción de la luz será pequeña al entrar en la lente (el aceite y el vidrio son ópticamente muy similares). Se debe utilizar el aceite de inmersión correcto para una lente de objetivo para garantizar que los índices de refracción coincidan estrechamente. El uso de una lente de inmersión en aceite con el aceite de inmersión incorrecto, o sin aceite de inmersión por completo, sufrirá aberración esférica. La fuerza de este efecto depende del tamaño del desajuste del índice de refracción.
La inmersión en aceite generalmente solo se puede utilizar en muestras montadas rígidamente, de lo contrario, la tensión superficial del aceite puede mover el cubreobjetos y, por lo tanto, mover la muestra que se encuentra debajo. Esto también puede suceder en microscopios invertidos porque el cubreobjetos está debajo del portaobjetos.
Antes del desarrollo de los aceites de inmersión sintéticos en la década de 1940, el aceite de cedro se utilizaba ampliamente. El aceite de cedro tiene un índice de refracción de aproximadamente 1,516. La apertura numérica de los objetivos del aceite de cedro suele ser de alrededor de 1,3. Sin embargo, el aceite de cedro tiene una serie de desventajas: absorbe la luz azul y ultravioleta, se vuelve amarilla con el tiempo, tiene suficiente acidez como para dañar potencialmente los objetivos con el uso repetido (al atacar el cemento utilizado para unir las lentes ) y diluirlo con solvente cambia su viscosidad ( e índice de refracción y dispersión ). El aceite de cedro debe eliminarse del objetivo inmediatamente después de su uso antes de que pueda endurecerse, ya que retirar el aceite de cedro endurecido puede dañar la lente. [2]
En la microscopía moderna se utilizan con mayor frecuencia aceites de inmersión sintéticos, ya que eliminan la mayoría de estos problemas. [2] Se pueden alcanzar valores NA de 1,6 con diferentes aceites. A diferencia de los aceites naturales, los sintéticos no se endurecen en la lente y normalmente se pueden dejar en el objetivo durante meses, aunque para mantener mejor el microscopio es mejor quitar el aceite a diario. Con el tiempo, el aceite puede entrar por la lente frontal del objetivo o en el cilindro del objetivo y dañar el objetivo. Existen diferentes tipos de aceites de inmersión con diferentes propiedades según el tipo de microscopía que realizará. Tanto el tipo A como el tipo B son aceites de inmersión de uso general con diferentes viscosidades. El aceite de inmersión tipo F se utiliza mejor para imágenes fluorescentes a temperatura ambiente (23 °C), mientras que el aceite tipo N está diseñado para usarse a temperatura corporal (37 °C) para aplicaciones de imágenes de células vivas. Todos tienen un D de 1.515, bastante similar al aceite de cedro original. [3]
