La hibridación genómica comparativa ( CGH ) es un método citogenético molecular para analizar las variaciones del número de copias (CNV) en relación con el nivel de ploidía en el ADN de una muestra de prueba en comparación con una muestra de referencia, sin la necesidad de cultivar células. El objetivo de esta técnica es comparar de forma rápida y eficiente dos muestras de ADN genómico que surgen de dos fuentes, que en la mayoría de los casos están estrechamente relacionadas, porque se sospecha que contienen diferencias en términos de ganancias o pérdidas de cromosomas completos o regiones subcromosómicas (una porción de un cromosoma completo). Esta técnica se desarrolló originalmente para la evaluación de las diferencias entre los complementos cromosómicos de tumores sólidos y tejido normal, [1] y tiene una resolución mejorada de 5 a 10 megabases en comparación con las técnicas de análisis citogenético más tradicionales de bandas de Giemsa e hibridación in situ con fluorescencia (FISH), que están limitadas por la resolución del microscopio utilizado. [2] [3]
Esto se logra mediante el uso de hibridación in situ con fluorescencia competitiva. En resumen, esto implica el aislamiento del ADN de las dos fuentes que se van a comparar, más comúnmente una fuente de prueba y una de referencia, el marcado independiente de cada muestra de ADN con fluoróforos (moléculas fluorescentes) de diferentes colores (generalmente rojo y verde), la desnaturalización del ADN para que sea monocatenario y la hibridación de las dos muestras resultantes en una proporción de 1:1 con una distribución normal en metafase de cromosomas, a la que se unirán las muestras de ADN marcadas en su locus de origen. Utilizando un microscopio de fluorescencia y un software de computadora, las señales fluorescentes de color diferencial se comparan a continuación a lo largo de la longitud de cada cromosoma para identificar las diferencias cromosómicas entre las dos fuentes. Una mayor intensidad del color de la muestra de prueba en una región específica de un cromosoma indica la ganancia de material de esa región en la muestra fuente correspondiente, mientras que una mayor intensidad del color de la muestra de referencia indica la pérdida de material en la muestra de prueba en esa región específica. Un color neutro (amarillo cuando las etiquetas del fluoróforo son rojas y verdes) indica que no hay diferencias entre las dos muestras en esa ubicación. [2] [3]
La CGH sólo es capaz de detectar anomalías cromosómicas desequilibradas , ya que las anomalías cromosómicas equilibradas, como las translocaciones recíprocas , las inversiones o los cromosomas en anillo , no afectan al número de copias, que es lo que se detecta mediante las tecnologías CGH. Sin embargo, la CGH permite la exploración de los 46 cromosomas humanos en una sola prueba y el descubrimiento de deleciones y duplicaciones, incluso a escala microscópica, lo que puede conducir a la identificación de genes candidatos para ser explorados más a fondo mediante otras técnicas citológicas. [2]
Mediante el uso de microarreglos de ADN junto con técnicas de CGH, se ha desarrollado la forma más específica de CGH de arreglo (aCGH), que permite una medición locus por locus de CNV con una resolución aumentada de tan solo 100 kilobases . [4] [5] Esta técnica mejorada permite descubrir la etiología de condiciones conocidas y desconocidas.
La motivación subyacente al desarrollo de CGH surgió del hecho de que las formas de análisis citogenético disponibles en ese momento ( bandas de Giemsa y FISH ) estaban limitadas en su resolución potencial por los microscopios necesarios para la interpretación de los resultados que proporcionaban. Además, la interpretación de las bandas de Giemsa tiene el potencial de ser ambigua y, por lo tanto, ha reducido la confiabilidad, y ambas técnicas requieren un alto nivel de mano de obra que limita los loci que se pueden examinar. [4]
El primer informe sobre análisis de CGH fue realizado por Kallioniemi y sus colegas en 1992 en la Universidad de California en San Francisco, quienes utilizaron CGH en el análisis de tumores sólidos. Lo lograron mediante la aplicación directa de la técnica tanto a líneas celulares de cáncer de mama como a tumores primarios de vejiga con el fin de establecer cariotipos completos del número de copias de las células. Fueron capaces de identificar 16 regiones diferentes de amplificación, muchas de las cuales fueron descubrimientos novedosos. [1]
Poco después, en 1993, Du Manoir et al. informaron sobre una metodología prácticamente idéntica. Los autores pintaron una serie de cromosomas humanos individuales de una biblioteca de ADN con dos fluoróforos diferentes en diferentes proporciones para probar la técnica, y también aplicaron CGH al ADN genómico de pacientes afectados por síndrome de Down o leucemia prolinfocítica de células T, así como a células de una línea celular de carcinoma papilar renal. Se concluyó que las proporciones de fluorescencia obtenidas eran precisas y que las diferencias entre el ADN genómico de diferentes tipos de células eran detectables y, por lo tanto, que CGH era una herramienta de análisis citogenético muy útil. [6]
Inicialmente, el uso generalizado de la tecnología CGH fue difícil, ya que los protocolos no eran uniformes y, por lo tanto, surgían inconsistencias, especialmente debido a las incertidumbres en la interpretación de los datos. [3] Sin embargo, en 1994 se publicó una revisión que describía en detalle un protocolo de fácil comprensión [7] y el software de análisis de imágenes se puso a disposición comercial, lo que permitió que la CGH se utilizara en todo el mundo. [3] A medida que se disponía de nuevas técnicas como la microdisección y la reacción en cadena de la polimerasa con oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR) para la generación de productos de ADN, fue posible aplicar el concepto de CGH a anomalías cromosómicas más pequeñas y, por lo tanto, se mejoró la resolución de la CGH. [3]
La implementación de array CGH, mediante el cual se utilizan microarrays de ADN en lugar de la preparación tradicional de cromosomas en metafase, fue iniciada por Solinas-Tolodo et al. en 1997 utilizando células tumorales [8] y Pinkel et al. en 1998 mediante el uso de células de cáncer de mama. [9] Esto fue posible gracias al Proyecto Genoma Humano que generó una biblioteca de fragmentos de ADN clonados con ubicaciones conocidas en todo el genoma humano , y estos fragmentos se utilizan como sondas en el microarray de ADN. [10] Ahora se pueden utilizar sondas de diversos orígenes, como ADNc, productos de PCR genómica y cromosomas artificiales bacterianos (BAC) en microarrays de ADN que pueden contener hasta 2 millones de sondas. [10] El CGH de matriz está automatizado, permite una mayor resolución (hasta 100 kb) que el CGH tradicional ya que las sondas son mucho más pequeñas que las preparaciones en metafase, requiere menores cantidades de ADN, se puede dirigir a regiones cromosómicas específicas si es necesario y está ordenado y, por lo tanto, es más rápido de analizar, lo que lo hace mucho más adaptable a usos de diagnóstico. [10] [11]
El ADN en el portaobjetos es una muestra de referencia y, por lo tanto, se obtiene de un hombre o una mujer cariotípicamente normales, aunque es preferible utilizar ADN femenino, ya que poseen dos cromosomas X que contienen mucha más información genética que el cromosoma Y masculino. Se utilizan linfocitos de sangre periférica estimulados con fitohemaglutinina. Se añade 1 ml de sangre heparinizada a 10 ml de medio de cultivo y se incuba durante 72 horas a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO 2 . Se añade colchicina para detener las células en mitosis, luego las células se recolectan y se tratan con cloruro de potasio hipotónico y se fijan en metanol / ácido acético 3: 1. [ 3]
A continuación, se debe dejar caer una gota de la suspensión celular sobre un portaobjetos limpiado con etanol desde una distancia de unos 30 cm; lo mejor es hacerlo a temperatura ambiente y con niveles de humedad del 60 al 70 %. Los portaobjetos se deben evaluar mediante visualización con un microscopio de contraste de fases; se debe observar un citoplasma mínimo y los cromosomas no deben superponerse y deben tener una longitud de 400 a 550 bandas sin cromátidas separadas y, por último, deben verse oscuros en lugar de brillantes. A continuación, los portaobjetos deben secarse al aire durante la noche a temperatura ambiente y cualquier almacenamiento posterior debe realizarse en grupos de cuatro a -20 °C con perlas de sílice o nitrógeno presentes para mantener la sequedad. Se deben probar diferentes donantes, ya que la hibridación puede ser variable. Se pueden utilizar portaobjetos disponibles comercialmente, pero siempre se deben probar primero. [3]
La extracción estándar con fenol se utiliza para obtener ADN de tejido de prueba o de referencia (individuo cariotípicamente normal), que implica la combinación de ácido Tris - etilendiaminotetraacético y fenol con ADN acuoso en cantidades iguales. A esto le sigue la separación por agitación y centrifugación, después de lo cual se retira la capa acuosa y se trata con éter y, finalmente, se utiliza la precipitación con etanol para concentrar el ADN. [3]
Puede completarse utilizando kits de aislamiento de ADN disponibles comercialmente que se basan en columnas de afinidad . [3]
Preferentemente, el ADN debe extraerse de tejido fresco o congelado, ya que será de la más alta calidad, aunque ahora es posible utilizar material de archivo fijado con formalina o embebido en parafina, siempre que se sigan los procedimientos adecuados. 0,5-1 μg de ADN es suficiente para el experimento CGH, aunque si no se obtiene la cantidad deseada, se puede aplicar DOP-PCR para amplificar el ADN; sin embargo, en este caso es importante aplicar DOP-PCR tanto a las muestras de ADN de prueba como de referencia para mejorar la confiabilidad. [3]
La traducción de nick se utiliza para etiquetar el ADN e implica cortar el ADN y sustituir nucleótidos marcados con fluoróforos (marcado directo) o biotina u oxigenina para que se añadan posteriormente anticuerpos conjugados con fluoróforos (marcado indirecto). A continuación, es importante comprobar las longitudes de los fragmentos del ADN de prueba y de referencia mediante electroforesis en gel , ya que deben estar dentro del rango de 500 kb a 1500 kb para una hibridación óptima. [3]
El ADN Cot-1 de Unlabeled Life Technologies Corporation (ADN placentario enriquecido con secuencias repetitivas de longitud de 50 pb a 100 pb) se agrega para bloquear las secuencias de ADN repetitivas normales, particularmente en los centrómeros y telómeros , ya que estas secuencias, si se detectan, pueden reducir la relación de fluorescencia y causar ganancias o pérdidas que escapen a la detección. [3]
Se mezclan entre 8 y 12 μl de cada uno de los ADN de prueba marcados y de referencia marcados y se añaden 40 μg de ADN Cot-1, luego se precipitan y posteriormente se disuelven en 6 μl de mezcla de hibridación, que contiene 50 % de formamida para disminuir la temperatura de fusión del ADN y 10 % de sulfato de dextrano para aumentar la concentración efectiva de la sonda en una solución de citrato de sodio salino (SSC) a un pH de 7,0. [3]
La desnaturalización del portaobjetos y de las sondas se lleva a cabo por separado. El portaobjetos se sumerge en formamida al 70 %/2xSSC durante 5 a 10 minutos a 72 °C, mientras que las sondas se desnaturalizan por inmersión en un baño de agua a 80 °C durante 10 minutos y se añaden inmediatamente a la preparación del portaobjetos en metafase. A continuación, esta reacción se cubre con un cubreobjetos y se deja durante dos a cuatro días en una cámara húmeda a 40 °C. [3]
Luego se retira el cubreobjetos y se aplican lavados de 5 minutos, tres usando 2xSSC a temperatura ambiente, uno a 45 °C con 0,1xSSC y uno usando TNT a temperatura ambiente. Luego se preincuba la reacción durante 10 minutos y luego se realiza una incubación de 60 minutos a 37 °C, tres lavados más de 5 minutos con TNT y luego uno con 2xSSC a temperatura ambiente. Luego se seca el portaobjetos usando una serie de etanol de 70%/96%/100% antes de contrateñirlo con DAPI (0,35 μg/ml), para la identificación de los cromosomas, y se sella con un cubreobjetos. [3]
Para la visualización se requiere un microscopio de fluorescencia con los filtros adecuados para la tinción DAPI , así como para los dos fluoróforos utilizados, y estos filtros también deben minimizar la diafonía entre los fluoróforos, como los filtros de paso de banda estrecha. El microscopio debe proporcionar una iluminación uniforme sin variación cromática , estar adecuadamente alineado y tener un objetivo de tipo "plan" que sea apocromático y proporcione un aumento de x63 o x100. [3]
La imagen debe ser captada con una cámara con una resolución espacial de al menos 0,1 μm a nivel de la muestra y proporcionar una imagen de al menos 600x600 píxeles. La cámara también debe ser capaz de integrar la imagen durante al menos 5 a 10 segundos, con una resolución fotométrica mínima de 8 bits. [3]
El software CGH dedicado está disponible comercialmente para el paso de procesamiento de imágenes y es necesario para restar el ruido de fondo, eliminar y segmentar materiales que no son de origen cromosómico, normalizar la relación de fluorescencia, realizar cariotipos interactivos y escalamiento de cromosomas a longitud estándar. Se genera un "cariotipo de número de copias relativo" que presenta áreas cromosómicas de deleciones o amplificaciones promediando las relaciones de una serie de metafases de alta calidad y trazándolas a lo largo de un ideograma, un diagrama que identifica cromosomas en función de patrones de bandas. La interpretación de los perfiles de relación se lleva a cabo utilizando umbrales fijos o estadísticos ( intervalos de confianza ). Cuando se utilizan intervalos de confianza, se identifican ganancias o pérdidas cuando el 95% de la relación de fluorescencia no contiene 1,0. [3]
Se debe tener mucho cuidado para evitar la contaminación de cualquier paso que involucre ADN, especialmente con el ADN de prueba, ya que la contaminación de la muestra con ADN normal sesgará los resultados acercándolos a 1,0, por lo que las anormalidades pueden pasar desapercibidas. Se pueden emplear experimentos de hibridación in situ con fluorescencia, PCR y citometría de flujo para confirmar los resultados. [4] [12]
La hibridación genómica comparativa en matriz (también hibridación genómica comparativa basada en microarrays, CGH en matriz, CGH en matriz, aCGH) es una técnica citogenética molecular para la detección de cambios en el número de copias cromosómicas a escala de todo el genoma y de alta resolución. [13] La CGH en matriz compara el genoma del paciente con un genoma de referencia e identifica diferencias entre los dos genomas y, por lo tanto, localiza regiones de desequilibrios genómicos en el paciente, utilizando los mismos principios de hibridación in situ con fluorescencia competitiva que la CGH tradicional.
Con la introducción del array CGH, se supera la principal limitación del CGH convencional, la baja resolución. En el array CGH, los cromosomas en metafase se sustituyen por fragmentos de ADN clonados (+100–200 kb) de los que se conoce la localización cromosómica exacta. Esto permite detectar aberraciones con más detalle y, además, hace posible mapear los cambios directamente sobre la secuencia genómica. [14]
El array CGH ha demostrado ser una técnica específica, sensible, rápida y de alto rendimiento, con ventajas considerables en comparación con otros métodos utilizados para el análisis de cambios en el número de copias de ADN, lo que lo hace más adecuado para aplicaciones de diagnóstico. Utilizando este método, se pueden detectar cambios en el número de copias a un nivel de 5 a 10 kilobases de secuencias de ADN. [15] A partir de 2006 [actualizar], incluso los arrays CGH de alta resolución (HR-CGH) son precisos para detectar variaciones estructurales (SV) a una resolución de 200 pb. [16] Este método permite identificar nuevos cambios cromosómicos recurrentes, como microdeleciones y duplicaciones en enfermedades humanas como el cáncer y los defectos de nacimiento debido a aberraciones cromosómicas.
La técnica CGH de matriz se basa en el mismo principio que la CGH convencional. En ambas técnicas, el ADN de una muestra de referencia (o de control) y el ADN de una muestra de prueba (o de paciente) se marcan de forma diferencial con dos fluoróforos diferentes y se utilizan como sondas que se cohibridan de forma competitiva sobre dianas de ácido nucleico . En la CGH convencional, la diana es una metafase de referencia extendida. En la CGH de matriz, estas dianas pueden ser fragmentos genómicos clonados en una variedad de vectores (como BAC o plásmidos ), ADNc u oligonucleótidos . [17]
Figura 2. [14] es una descripción esquemática de la técnica de CGH de matriz. El ADN de la muestra que se va a analizar se marca con un fluoróforo rojo ( cianina 5) y una muestra de ADN de referencia se marca con un fluoróforo verde (cianina 3). Se mezclan cantidades iguales de las dos muestras de ADN y se cohibridan para formar una micromatriz de ADN de varios miles de fragmentos de ADN clonados u oligonucleótidos espaciados uniformemente, que se han colocado por triplicado en la matriz. Después de la hibridación, se utilizan sistemas de imágenes digitales para capturar y cuantificar las intensidades de fluorescencia relativas de cada uno de los fluoróforos hibridados. [17] La relación resultante de las intensidades de fluorescencia es proporcional a la relación de los números de copias de secuencias de ADN en los genomas de prueba y de referencia. Si las intensidades de los fluorócromos son iguales en una sonda, se interpreta que esta región del genoma del paciente tiene la misma cantidad de ADN en las muestras de prueba y de referencia; Si hay una relación Cy3:Cy5 alterada, esto indica una pérdida o una ganancia del ADN del paciente en esa región genómica específica. [18]
El CGH de matriz se ha implementado utilizando una amplia variedad de técnicas. Por lo tanto, algunas de las ventajas y limitaciones del CGH de matriz dependen de la técnica elegida. Los enfoques iniciales utilizaban matrices producidas a partir de clones de ADN genómico de inserción grande, como BAC . El uso de BAC proporciona señales lo suficientemente intensas como para detectar cambios de copia única y localizar límites de aberración con precisión. Sin embargo, los rendimientos iniciales de ADN de clones de BAC aislados son bajos y son necesarias técnicas de amplificación de ADN. Estas técnicas incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por ligadura , PCR de cebador degenerado utilizando uno o varios conjuntos de cebadores y amplificación por círculo rodante . [19] Las matrices también se pueden construir utilizando ADNc. Estas matrices actualmente producen una alta resolución espacial, pero el número de ADNc está limitado por los genes que están codificados en los cromosomas, y su sensibilidad es baja debido a la hibridación cruzada. [14] Esto da como resultado la incapacidad de detectar cambios de copia única a escala de todo el genoma. [20] El enfoque más reciente es detectar las matrices con oligonucleótidos cortos. La cantidad de oligonucleótidos es casi infinita y el procesamiento es rápido, rentable y sencillo. Aunque los oligonucleótidos no tienen la sensibilidad necesaria para detectar cambios en copias individuales, el promedio de las proporciones de oligonucleótidos que se asignan uno al lado del otro en el cromosoma puede compensar la sensibilidad reducida. [21] También es posible utilizar matrices que tengan sondas superpuestas para poder descubrir puntos de ruptura específicos.
Hay dos enfoques para el diseño de microarrays para aplicaciones CGH: genoma completo y específico.
Los arrays de genoma completo están diseñados para cubrir todo el genoma humano. A menudo incluyen clones que proporcionan una amplia cobertura en todo el genoma y arrays que tienen una cobertura contigua, dentro de los límites del genoma. Los arrays de genoma completo se han construido principalmente para aplicaciones de investigación y han demostrado su extraordinario valor en el descubrimiento de genes. También son muy valiosos para examinar el genoma en busca de ganancias y pérdidas de ADN con una resolución sin precedentes. [17]
Los microarrays dirigidos están diseñados para una o más regiones específicas del genoma con el fin de evaluar ese segmento específico. Pueden estar diseñados para estudiar un cromosoma o segmento cromosómico específico o para identificar y evaluar anomalías específicas en la dosis de ADN en individuos con sospecha de síndromes de microdeleción o reordenamientos subteloméricos. El objetivo fundamental de un microarray dirigido en la práctica médica es proporcionar resultados clínicamente útiles para el diagnóstico, el asesoramiento genético, el pronóstico y el tratamiento clínico de anomalías citogenéticas desequilibradas. [17]
La CGH convencional se ha utilizado principalmente para la identificación de regiones cromosómicas que se pierden o ganan de forma recurrente en los tumores, así como para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. [22] Este enfoque también se puede utilizar para estudiar aberraciones cromosómicas en genomas fetales y neonatales . Además, la CGH convencional se puede utilizar para detectar anomalías cromosómicas y se ha demostrado que es eficaz en el diagnóstico de anomalías complejas asociadas con trastornos genéticos humanos. [14]
Los datos de CGH de varios estudios del mismo tipo de tumor muestran patrones consistentes de aberraciones genéticas no aleatorias. [23] Algunos de estos cambios parecen ser comunes a varios tipos de tumores malignos, mientras que otros son más específicos del tumor. Por ejemplo, las ganancias de las regiones cromosómicas lq, 3q y 8q, así como las pérdidas de 8p, 13q, 16q y 17p, son comunes a varios tipos de tumores, como el cáncer de mama, ovario, próstata, riñón y vejiga (Figura 3). Otras alteraciones, como las ganancias de 12p y Xp en el cáncer testicular, la ganancia de 13q y la pérdida de 9q en el cáncer de vejiga, la pérdida de 14q en el cáncer renal y la pérdida de Xp en el cáncer de ovario son más específicas y podrían reflejar las fuerzas de selección únicas que operan durante el desarrollo del cáncer en diferentes órganos. [23] El Array CGH también se utiliza con frecuencia en la investigación y el diagnóstico de neoplasias malignas de células B, como la leucemia linfocítica crónica.
El síndrome del maullido del gato (CdC) es un síndrome causado por una deleción parcial del brazo corto del cromosoma 5. [24] Varios estudios han demostrado que la CGH convencional es adecuada para detectar la deleción, así como alteraciones cromosómicas más complejas. Por ejemplo, Levy et al. (2002) informaron sobre un bebé con un llanto parecido al de un gato, el sello distintivo del CdC, pero que tenía un cariotipo indistinto. El análisis de CGH reveló una pérdida de material cromosómico de 5p15.3, lo que confirmó el diagnóstico clínicamente. Estos resultados demuestran que la CGH convencional es una técnica confiable para detectar aberraciones estructurales y, en casos específicos, puede ser más eficiente para diagnosticar anomalías complejas. [24]
Las aplicaciones de la CGH de matriz están dirigidas principalmente a detectar anomalías genómicas en el cáncer. Sin embargo, la CGH de matriz también es adecuada para el análisis de aberraciones en el número de copias de ADN que causan trastornos genéticos humanos. [14] Es decir, la CGH de matriz se utiliza para descubrir deleciones, amplificaciones, puntos de ruptura y anomalías de ploidía. El diagnóstico temprano es beneficioso para el paciente, ya que puede someterse a tratamientos y asesoramiento adecuados para mejorar su pronóstico. [10]
Las alteraciones y reordenamientos genéticos ocurren con frecuencia en el cáncer y contribuyen a su patogénesis. La detección de estas aberraciones mediante array CGH proporciona información sobre las ubicaciones de genes importantes del cáncer y puede tener un uso clínico en el diagnóstico, la clasificación del cáncer y el pronóstico. [17] Sin embargo, no todas las pérdidas de material genético son patogénicas, ya que parte del material de ADN se pierde fisiológicamente durante el reordenamiento de los subgenes de inmunoglobulina. En un estudio reciente, se ha implementado array CGH para identificar regiones de aberración cromosómica ( variación del número de copias ) en varios modelos de ratón de cáncer de mama, lo que conduce a la identificación de genes cooperadores durante la oncogénesis inducida por myc. [25]
La técnica Array CGH también puede aplicarse no sólo al descubrimiento de anomalías cromosómicas en el cáncer, sino también al seguimiento de la progresión de los tumores. La diferenciación entre lesiones metastásicas y leves también es posible mediante FISH una vez que se han identificado las anomalías mediante la técnica Array CGH. [5] [10]
El síndrome de Prader-Willi (PWS) es una anomalía estructural paterna que afecta a 15q11-13, mientras que una aberración materna en la misma región causa el síndrome de Angelman (AS). En ambos síndromes, la mayoría de los casos (75%) son el resultado de una deleción de 3 a 5 Mb de la región crítica PWS/AS. [26] Estas pequeñas aberraciones no se pueden detectar mediante citogenética o CGH convencional, pero se pueden detectar fácilmente mediante CGH de matriz. Como prueba de principio, Vissers et al. (2003) construyeron una matriz de todo el genoma con una resolución de 1 Mb para examinar a tres pacientes con síndromes de microdeleción conocidos y confirmados mediante FISH, incluido uno con PWS. En los tres casos, las anomalías, que oscilaban entre 1,5 y 2,9 Mb, se identificaron fácilmente. [27] Por lo tanto, se demostró que la CGH de matriz es un enfoque específico y sensible para detectar aberraciones submicroscópicas.
Al utilizar microarrays superpuestos, también es posible descubrir puntos de ruptura involucrados en aberraciones cromosómicas.
Aunque todavía no es una técnica ampliamente utilizada, el uso de array CGH como herramienta para el cribado genético preimplantacional se está convirtiendo en un concepto cada vez más popular. Tiene el potencial de detectar CNV y aneuploidías en óvulos, espermatozoides o embriones que pueden contribuir a la imposibilidad de que el embrión se implante con éxito, abortos espontáneos o afecciones como el síndrome de Down (trisomía 21). Esto hace que el array CGH sea una herramienta prometedora para reducir la incidencia de afecciones que alteran la vida y mejorar las tasas de éxito de los intentos de FIV . La técnica implica la amplificación del genoma completo a partir de una sola célula que luego se utiliza en el método array CGH. También se puede utilizar en parejas portadoras de translocaciones cromosómicas , como translocaciones recíprocas equilibradas o translocaciones robertsonianas, que tienen el potencial de causar desequilibrios cromosómicos en su descendencia. [12] [28] [29]
Una desventaja principal del CGH convencional es su incapacidad para detectar aberraciones cromosómicas estructurales sin cambios en el número de copias , como mosaicismo , translocaciones cromosómicas equilibradas e inversiones . El CGH también solo puede detectar ganancias y pérdidas en relación con el nivel de ploidía. [30] Además, las regiones cromosómicas con secuencias cortas de ADN repetitivas son muy variables entre individuos y pueden interferir con el análisis CGH. [14] Por lo tanto, las regiones de ADN repetitivas como los centrómeros y los telómeros deben bloquearse con ADN repetitivo no marcado (por ejemplo, ADN Cot1) y/o pueden omitirse del cribado. [31] Además, la resolución del CGH convencional es un problema práctico importante que limita sus aplicaciones clínicas. Aunque el CGH ha demostrado ser una técnica útil y fiable en la investigación y el diagnóstico tanto del cáncer como de los trastornos genéticos humanos, las aplicaciones implican solo anomalías macroscópicas. Debido a la resolución limitada de los cromosomas en metafase, las aberraciones menores de 5-10 Mb no se pueden detectar utilizando el CGH convencional. [23] Para la detección de tales anomalías, se requiere una técnica de alta resolución. El Array CGH supera muchas de estas limitaciones. El Array CGH se caracteriza por una alta resolución, su principal ventaja con respecto al CGH convencional. La resolución estándar varía entre 1 y 5 Mb, pero se puede aumentar hasta aproximadamente 40 kb complementando el array con clones adicionales. Sin embargo, como en el CGH convencional, la principal desventaja del array CGH es su incapacidad para detectar aberraciones que no resulten en cambios en el número de copias y su capacidad para detectar mosaicismos es limitada. [14] El nivel de mosaicismo que se puede detectar depende de la sensibilidad y la resolución espacial de los clones. En la actualidad, los reordenamientos presentes en aproximadamente el 50% de las células son el límite de detección. Para la detección de tales anomalías, todavía se deben utilizar otras técnicas, como SKY (cariotipo espectral) o FISH. [32]