Los knockouts de genes (también conocidos como eliminación de genes o inactivación de genes ) son una técnica de ingeniería genética ampliamente utilizada que implica la eliminación o inactivación dirigida de un gen específico dentro del genoma de un organismo. Esto se puede hacer mediante una variedad de métodos, incluida la recombinación homóloga , CRISPR-Cas9 y TALEN .
Una de las principales ventajas de los genes knockout es que permiten a los investigadores estudiar la función de un gen específico in vivo y comprender el papel del gen en el desarrollo y la fisiología normales, así como en la patología de las enfermedades. Al estudiar el fenotipo del organismo con el gen desactivado, los investigadores pueden obtener información sobre los procesos biológicos en los que participa el gen.
Hay dos tipos principales de genes knockout: completos y condicionales. Una desactivación genética completa inactiva permanentemente el gen, mientras que una desactivación genética condicional permite que el gen se active y desactive en momentos específicos o en tejidos específicos. Los knockouts condicionales son particularmente útiles para estudiar procesos de desarrollo y para comprender el papel de un gen en tipos de células o tejidos específicos.
Los genes knockout se han utilizado ampliamente en muchos organismos diferentes, incluidas bacterias, levaduras, moscas de la fruta, peces cebra y ratones. En ratones, los genes knockout se utilizan comúnmente para estudiar la función de genes específicos en el desarrollo, la fisiología y la investigación del cáncer.
El uso de genes knockout en modelos de ratón ha sido particularmente valioso en el estudio de enfermedades humanas. Por ejemplo, se han utilizado genes knockout en ratones para estudiar el papel de genes específicos en el cáncer, los trastornos neurológicos, los trastornos inmunitarios y los trastornos metabólicos.
Sin embargo, los genes knockout también tienen algunas limitaciones. Por ejemplo, la pérdida de un solo gen puede no imitar completamente los efectos de un trastorno genético, y las eliminaciones pueden tener efectos no deseados en otros genes o vías. Además, los genes knockout no siempre son un buen modelo para las enfermedades humanas, ya que el genoma del ratón no es idéntico al genoma humano y la fisiología del ratón es diferente de la fisiología humana.
La técnica KO es esencialmente lo opuesto a la activación genética . La eliminación simultánea de dos genes en un organismo se conoce como doble eliminación ( DKO ). De manera similar, los términos triple knockout ( TKO ) y cuádruple knockout ( QKO ) se utilizan para describir tres o cuatro genes desactivados, respectivamente. Sin embargo, es necesario distinguir entre KO heterocigotos y homocigotos . En el primero, sólo una de las dos copias del gen ( alelos ) queda eliminada, en el segundo, ambas quedan eliminadas.
Los nocauts se logran mediante una variedad de técnicas. Originalmente, se identificaban mutaciones que ocurrían de forma natural y luego había que establecer la pérdida o inactivación de genes mediante secuenciación de ADN u otros métodos. [1]
La eliminación de genes por mutación se lleva a cabo comúnmente en bacterias. Un ejemplo temprano del uso de esta técnica en Escherichia coli fue publicado en 1989 por Hamilton et al. [2] En este experimento, se utilizaron dos recombinaciones secuenciales para eliminar el gen. Este trabajo estableció la viabilidad de eliminar o reemplazar un gen funcional en bacterias. Desde entonces, ese método se ha desarrollado para otros organismos, en particular animales de investigación, como los ratones. Los ratones knockout se utilizan comúnmente para estudiar genes con equivalentes humanos que pueden tener importancia para la enfermedad. Un ejemplo de un estudio que utiliza ratones knockout es una investigación de las funciones de las proteínas Xirp en el síndrome de muerte nocturna súbita e inexplicable (SUNDS) y el síndrome de Brugada en la población china Han. [3]
Para las investigaciones de genes knockout, la interferencia de ARN (RNAi), un método más reciente, también conocido como silenciamiento de genes, ha ganado popularidad. En la interferencia de ARN (ARNi), el ARN mensajero de un gen particular se desactiva utilizando un pequeño ARN de interferencia (ARNip) o un ARN de horquilla corta (ARNsh). Esto efectivamente impide que el gen se exprese. Oncogenes como Bcl-2 y p53, así como genes relacionados con enfermedades neurológicas, trastornos genéticos e infecciones virales, han sido el objetivo del silenciamiento génico utilizando ARN de interferencia (ARNi). [ cita necesaria ]
La recombinación homóloga es el intercambio de genes entre dos cadenas de ADN que incluyen regiones extensas de secuencias de bases idénticas entre sí. En especies eucariotas, bacterias y algunos virus, la recombinación homóloga ocurre de forma espontánea y es una herramienta útil en la ingeniería genética. La recombinación homóloga, que tiene lugar durante la meiosis en eucariotas, es esencial para la reparación de roturas del ADN de doble cadena y promueve la variación genética al permitir el movimiento de información genética durante el cruce cromosómico. La recombinación homóloga, un mecanismo clave de reparación del ADN en bacterias, permite la inserción de material genético adquirido mediante la transferencia horizontal de genes y la transformación en ADN. La recombinación homóloga en virus influye en el curso de la evolución viral. La recombinación homóloga, un tipo de selección de genes utilizada en ingeniería genética, implica la introducción de una mutación diseñada en un gen particular para aprender más sobre la función de ese gen. Este método implica insertar ADN extraño en una célula que tiene una secuencia similar al gen objetivo mientras está flanqueada por secuencias que son las mismas aguas arriba y aguas abajo del gen objetivo. El ADN del gen diana se sustituye por la secuencia de ADN extraño durante la replicación cuando la célula detecta regiones flanqueantes similares como homólogas. El gen objetivo es "eliminado" por el intercambio. Al utilizar esta técnica para apuntar a alelos particulares en células madre embrionarias en ratones, es posible crear ratones knockout. Con la ayuda de la orientación genética, se han desactivado numerosos genes de ratón, lo que ha llevado a la creación de cientos de modelos de ratón distintos de diversas enfermedades humanas, como cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y trastornos neurológicos. [ cita necesaria ] Mario Capecchi, Sir Martin J. Evans y Oliver Smithies realizaron una investigación innovadora sobre la recombinación homóloga en células madre de ratón y compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007 por sus hallazgos. [4] Tradicionalmente, la recombinación homóloga era el método principal para provocar la desactivación de un gen. Este método implica la creación de una construcción de ADN que contiene la mutación deseada. Para fines de desactivación, esto normalmente implica un marcador de resistencia a fármacos en lugar del gen desactivador deseado. [5] La construcción también contendrá un mínimo de 2 kb de homología con la secuencia objetivo. La construcción se puede administrar a las células madre mediante microinyección o electroporación . Luego, este método se basa en los propios mecanismos de reparación de la célula para recombinar la construcción de ADN en el ADN existente. Esto da como resultado que se altere la secuencia del gen y, en la mayoría de los casos, el gen se traducirá .en una proteína no funcional , si es que se traduce. Sin embargo, este es un proceso ineficaz, ya que la recombinación homóloga representa sólo de 10 −2 a 10 −3 de las integraciones de ADN. [5] [6] A menudo, el marcador de selección de fármaco en la construcción se utiliza para seleccionar células en las que se ha producido el evento de recombinación.
Estas células madre que ahora carecen del gen podrían usarse in vivo , por ejemplo en ratones, insertándolas en embriones tempranos. Si el ratón quimérico resultante contuviera el cambio genético en su línea germinal, podría transmitirse a la descendencia. [5]
En los organismos diploides , que contienen dos alelos para la mayoría de los genes, y también pueden contener varios genes relacionados que colaboran en la misma función, se realizan rondas adicionales de transformación y selección hasta que se elimina cada gen objetivo. Es posible que se requiera cría selectiva para producir animales knockout homocigotos .
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Actualmente se utilizan tres métodos que implican apuntar con precisión a una secuencia de ADN para introducir una rotura de doble cadena. Una vez que esto ocurre, los mecanismos de reparación de la célula intentarán reparar esta rotura de doble cadena, a menudo mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ), que implica ligar directamente los dos extremos cortados. [6] Esto puede hacerse de manera imperfecta, por lo que a veces causa inserciones o eliminaciones de pares de bases, que causan mutaciones por cambio de marco . Estas mutaciones pueden hacer que el gen en el que ocurren no funcione, creando así una desactivación de ese gen. Este proceso es más eficiente que la recombinación homóloga y, por lo tanto, puede usarse más fácilmente para crear knockouts bialélicos. [6]
Las nucleasas con dedos de zinc consisten en dominios de unión al ADN que pueden apuntar con precisión a una secuencia de ADN. [6] Cada dedo de zinc puede reconocer codones de una secuencia de ADN deseada y, por lo tanto, puede ensamblarse de forma modular para unirse a una secuencia particular. [8] Estos dominios de unión están acoplados con una endonucleasa de restricción que puede causar una rotura de doble cadena (DSB) en el ADN. [6] Los procesos de reparación pueden introducir mutaciones que destruyen la funcionalidad del gen. [ cita necesaria ]
Las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción ( TALEN ) también contienen un dominio de unión al ADN y una nucleasa que puede escindir el ADN. [9] La región de unión al ADN consta de repeticiones de aminoácidos, cada una de las cuales reconoce un único par de bases de la secuencia de ADN objetivo deseada. [8] Si esta escisión está dirigida a una región codificante de un gen y la reparación mediada por NHEJ introduce inserciones y eliminaciones, a menudo se produce una mutación por cambio de marco, lo que altera la función del gen. [9]
CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, regularmente interespaciadas) es una técnica de ingeniería genética que permite la edición precisa del genoma. Una aplicación de CRISPR es la eliminación de genes, que implica desactivar o "eliminar" un gen específico en un organismo. [ cita necesaria ]
El proceso de eliminación de genes con CRISPR implica tres pasos principales: diseñar un ARN guía (ARNg) que se dirige a una ubicación específica en el genoma, entregar el ARNg y una enzima Cas9 (que actúa como una tijera molecular) a la célula objetivo, y luego permitiendo a la célula reparar el corte en el ADN. Cuando la célula repara el corte, puede volver a unir los extremos cortados, lo que da como resultado un gen no funcional, o introducir una mutación que interrumpe la función del gen.
Esta técnica se puede utilizar en una variedad de organismos, incluidas bacterias, levaduras, plantas y animales, y permite a los científicos estudiar la función de genes específicos observando los efectos de su ausencia. La desactivación genética basada en CRISPR es una herramienta poderosa para comprender la base genética de las enfermedades y desarrollar nuevas terapias.
Es importante señalar que la desactivación genética basada en CRISPR, como cualquier técnica de ingeniería genética, tiene el potencial de producir efectos no deseados o dañinos en el organismo, por lo que debe usarse con precaución. [8] [10] El Cas9 acoplado provocará una rotura de doble cadena en el ADN. [8] Siguiendo el mismo principio que los dedos de zinc y los TALEN, los intentos de reparar estas roturas de doble cadena a menudo resultan en mutaciones de cambio de marco que resultan en un gen no funcional. [8] La tecnología CRISPR-Cas9 no invasiva ha desactivado con éxito un gen asociado con la depresión y la ansiedad en ratones, siendo la primera entrega exitosa que atraviesa la barrera hematoencefálica para permitir la modificación genética. [11]
La activación de genes es similar a la eliminación de genes, pero reemplaza un gen por otro en lugar de eliminarlo. [ cita necesaria ]
Una desactivación genética condicional permite la eliminación de genes en un tejido de una manera específica. Esto es necesario en lugar de una eliminación genética si la mutación nula conduciría a la muerte embrionaria , [12] o si un tejido o tipo de célula específico es de interés específico. Esto se hace introduciendo secuencias cortas llamadas sitios loxP alrededor del gen. Estas secuencias se introducirán en la línea germinal mediante el mismo mecanismo que un knockout. Esta línea germinal luego se puede cruzar con otra línea germinal que contenga Cre-recombinasa , que es una enzima viral que puede reconocer estas secuencias, las recombina y elimina el gen flanqueado por estos sitios. [ cita necesaria ]
Los genes que no participan en el desarrollo temprano se han estudiado eficazmente mediante métodos de eliminación que utilizan la eliminación de genes. Sin embargo, normalmente no es posible eliminar genes que están activos durante el desarrollo temprano sin que el organismo sufra un desenlace fatal. Un método para solucionar esto es el nocaut condicional. Utilizando una recombinasa específica de sitio llamada Cre, la técnica de eliminación condicional original recombinó secuencias diana cortas conocidas como LoxP. Desde entonces, se han creado y empleado otras recombinasas en experimentos de eliminación condicional. [ cita necesaria ]
Los knockouts se utilizan principalmente para comprender el papel de un gen o región de ADN específico comparando el organismo knockout con un tipo salvaje con antecedentes genéticos similares . [ cita necesaria ]
Los organismos knockout también se utilizan como herramientas de detección en el desarrollo de fármacos , para atacar procesos biológicos específicos o deficiencias mediante el uso de un knockout específico, o para comprender el mecanismo de acción de un fármaco mediante el uso de una biblioteca de organismos knockout que abarcan todo el genoma , como como en Saccharomyces cerevisiae . [13]