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Nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción

Dibujo de relleno espacial de la fusión dimérica TALE-FokI (azul: TALE; verde: FokI) unida al ADN ( PDB : 1FOK, 3UGM ), por David Goodsell

Las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción ( TALEN ) son enzimas de restricción que pueden diseñarse para cortar secuencias específicas de ADN. Se obtienen fusionando un dominio de unión al ADN efector TAL con un dominio de escisión del ADN (una nucleasa que corta las hebras de ADN). Los efectores similares a activadores de la transcripción (TALE) se pueden diseñar para unirse a prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada, de modo que cuando se combinan con una nucleasa, el ADN se puede cortar en ubicaciones específicas. [1] Las enzimas de restricción se pueden introducir en las células, para su uso en la edición de genes o para la edición del genoma in situ , una técnica conocida como edición del genoma con nucleasas diseñadas . Junto con las nucleasas con dedos de zinc y CRISPR/Cas9 , TALEN es una herramienta destacada en el campo de la edición del genoma .

Dominio de unión al ADN de TALE

Los efectores TAL son proteínas secretadas por la bacteria Xanthomonas a través de su sistema de secreción tipo III cuando infectan plantas . [2] El dominio de unión al ADN contiene una secuencia repetida altamente conservada de 33 a 34 aminoácidos con los aminoácidos 12 y 13 divergentes. Estas dos posiciones, denominadas residuo variable repetido (RVD), son muy variables y muestran una fuerte correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos . [3] [4] Esta sencilla relación entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento del ADN ha permitido la ingeniería de dominios de unión al ADN específicos mediante la selección de una combinación de segmentos repetidos que contienen los RVD apropiados. [1] En particular, ligeros cambios en el RVD y la incorporación de secuencias RVD "no convencionales" pueden mejorar la especificidad de la focalización. [5]

dominio de escisión del ADN

El dominio de escisión de ADN no específico del extremo de la endonucleasa FokI se puede utilizar para construir nucleasas híbridas que sean activas en un ensayo en levadura. [6] [7] Estos reactivos también son activos en células vegetales [8] [9] y en células animales. [9] [10] [11] [12] Los estudios TALEN iniciales utilizaron el dominio de escisión FokI de tipo salvaje, pero algunos estudios TALEN posteriores [11] [13] [14] también utilizaron variantes del dominio de escisión FokI con mutaciones diseñadas para mejorar la escisión. especificidad [15] [16] y actividad de escisión. [17] El dominio FokI funciona como un dímero, lo que requiere dos construcciones con dominios de unión al ADN únicos para los sitios en el genoma objetivo con la orientación y el espaciado adecuados. Tanto el número de residuos de aminoácidos entre el dominio de unión al ADN de TALE y el dominio de escisión de FokI como el número de bases entre los dos sitios de unión de TALEN individuales parecen ser parámetros importantes para lograr altos niveles de actividad. [10] [18]

Ingeniería TALEN construye

La simple relación entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento del ADN del dominio de unión de TALE permite la ingeniería eficiente de proteínas. En este caso, la síntesis de genes artificiales es problemática debido a la hibridación inadecuada de la secuencia repetitiva encontrada en el dominio de unión de TALE. [19] Una solución a esto es utilizar un programa de software disponible públicamente (DNAWorks [20] ) para calcular los oligonucleótidos adecuados para el ensamblaje en un ensamblaje de oligonucleótidos por PCR de dos pasos seguido de la amplificación del gen completo. También se han informado varios esquemas de ensamblaje modular para generar construcciones TALE de ingeniería. [9] [19] [21] [22] [23] [24] Ambos métodos ofrecen un enfoque sistemático para diseñar dominios de unión al ADN que es conceptualmente similar al método de ensamblaje modular para generar dominios de reconocimiento de ADN con dedos de zinc .

Flujo de trabajo de edición del genoma de Tu gen favorito (YFG) usando TALEN. Se identifica la secuencia diana, se diseña una secuencia TALEN correspondiente y se inserta en un plásmido. El plásmido se inserta en la célula diana donde se traduce para producir el TALEN funcional, que ingresa al núcleo y se une y escinde la secuencia diana. Dependiendo de la aplicación, esto se puede utilizar para introducir un error (eliminar un gen objetivo) o para introducir una nueva secuencia de ADN en el gen objetivo.

Transfección

Una vez ensambladas las construcciones TALEN, se insertan en plásmidos ; Luego, las células diana se transfectan con los plásmidos y los productos genéticos se expresan y entran al núcleo para acceder al genoma. Alternativamente, las construcciones TALEN se pueden administrar a las células como ARNm, lo que elimina la posibilidad de integración genómica de la proteína que expresa TALEN. El uso de un vector de ARNm también puede aumentar drásticamente el nivel de reparación dirigida por homología (HDR) y el éxito de la introgresión durante la edición de genes.

Edición del genoma

Mecanismos

TALEN se puede utilizar para editar genomas induciendo roturas de doble hebra (DSB), a las que las células responden con mecanismos de reparación.

La unión de extremos no homólogos (NHEJ) liga directamente el ADN de cualquier lado de una rotura de doble hebra donde hay muy poca o ninguna superposición de secuencias para el recocido. Este mecanismo de reparación induce errores en el genoma mediante indeles (inserción o eliminación) o reordenamiento cromosómico; Cualquier error de este tipo puede hacer que los productos genéticos codificados en esa ubicación no sean funcionales. [10] Debido a que esta actividad puede variar dependiendo de la especie, el tipo de célula, el gen objetivo y la nucleasa utilizada, se debe monitorear al diseñar nuevos sistemas. Se puede realizar un ensayo de escisión heterodúplex simple que detecta cualquier diferencia entre dos alelos amplificados mediante PCR. Los productos de escisión se pueden visualizar en geles de agarosa simples o sistemas de gel en placa.

Alternativamente, se puede introducir ADN en un genoma a través de NHEJ en presencia de fragmentos de ADN bicatenario exógenos. [10]

La reparación dirigida por homología también puede introducir ADN extraño en la DSB, ya que las secuencias bicatenarias transfectadas se utilizan como plantillas para las enzimas reparadoras. [10]

Aplicaciones

TALEN se ha utilizado para modificar eficientemente genomas de plantas, [25] creando cultivos alimentarios económicamente importantes con cualidades nutricionales favorables. [26] También se han aprovechado para desarrollar herramientas para la producción de biocombustibles . [27] Además, se ha utilizado para diseñar células madre embrionarias humanas modificadas de forma estable y clones de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) y líneas celulares eritroides humanas, [11] [28] para generar C. elegans knockout , [12] knockout ratas , [13] ratones knockout, [29] y pez cebra knockout . [14] [30] Además, el método se puede utilizar para generar organismos knockin. Wu et al. obtuvieron un ganado con knockin Sp110 utilizando nickasas Talen para inducir una mayor resistencia a la tuberculosis. [31] Este enfoque también se ha utilizado para generar ratas knockin mediante microinyección de ARNm de TALEN en embriones unicelulares. [32]

TALEN también se ha utilizado experimentalmente para corregir los errores genéticos que subyacen a las enfermedades. [33] Por ejemplo, se ha utilizado in vitro para corregir los defectos genéticos que causan trastornos como la anemia de células falciformes , [28] [34] xeroderma pigmentoso , [35] y epidermólisis ampollosa . [36] Recientemente, se demostró que TALEN puede usarse como herramientas para aprovechar el sistema inmunológico para combatir el cáncer; La focalización mediada por TALEN puede generar células T que son resistentes a los fármacos quimioterapéuticos y muestran actividad antitumoral. [37] [38]

En teoría, la especificidad de todo el genoma de las fusiones TALEN diseñadas permite la corrección de errores en loci genéticos individuales mediante la reparación dirigida por homología a partir de una plantilla exógena correcta. [33] En realidad, sin embargo, la aplicación in situ de TALEN está actualmente limitada por la falta de un mecanismo de administración eficiente, factores inmunogénicos desconocidos y la incertidumbre en la especificidad de la unión de TALEN. [33]

Otra aplicación emergente de TALEN es su capacidad para combinarse con otras herramientas de ingeniería genómica, como las meganucleasas . La región de unión al ADN de un efector TAL se puede combinar con el dominio de escisión de una meganucleasa para crear una arquitectura híbrida que combina la facilidad de ingeniería y la actividad de unión al ADN altamente específica de un efector TAL con la baja frecuencia y especificidad del sitio de una meganucleasa. [39]

En comparación con otras técnicas de edición del genoma, TALEN se sitúa en el medio en términos de dificultad y coste. A diferencia de las ZFN , TALEN reconoce nucleótidos individuales. Es mucho más sencillo diseñar interacciones entre los dominios de unión al ADN de TALEN y sus nucleótidos objetivo que crear interacciones con las ZFN y sus tripletes de nucleótidos objetivo. [40] Por otro lado, CRISPR se basa en la formación de complejos de ribonucleótidos en lugar del reconocimiento de proteína/ADN. Los gRNA [ definición necesaria ] tienen ocasionalmente limitaciones en cuanto a viabilidad debido a la falta de sitios PAM [ definición necesaria ] en la secuencia objetivo y, aunque pueden producirse a bajo costo, el desarrollo actual conduce a una notable disminución del costo de los TALEN, por lo que son en un precio y rango de tiempo similar a la edición del genoma basada en CRISPR [ se necesita aclaración ] .

Precisión de la nucleasa efectora TAL

La actividad fuera del objetivo de una nucleasa activa puede provocar roturas no deseadas de la doble hebra y, en consecuencia, puede producir reordenamientos cromosómicos y/o muerte celular. Se han llevado a cabo estudios para comparar la toxicidad relativa asociada a las nucleasas de las tecnologías disponibles. Con base en estos estudios [18] y la distancia teórica máxima entre la unión al ADN y la actividad nucleasa, se cree que las construcciones TALEN tienen la mayor precisión de las tecnologías disponibles actualmente. [41]

Ver también

Referencias

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enlaces externos