La espectroscopia de fluorescencia (también conocida como fluorimetría o espectrofluorometría ) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Implica el uso de un haz de luz, normalmente luz ultravioleta , que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y hace que emitan luz; normalmente, pero no necesariamente, luz visible . Una técnica complementaria es la espectroscopia de absorción . En el caso especial de la espectroscopia de fluorescencia de una sola molécula, las fluctuaciones de intensidad de la luz emitida se miden a partir de fluoróforos individuales o pares de fluoróforos.
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros .
Las moléculas tienen varios estados denominados niveles de energía . La espectroscopia de fluorescencia se ocupa principalmente de los estados electrónicos y vibracionales. Generalmente, la especie que se examina tiene un estado electrónico fundamental (un estado de baja energía) de interés y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay varios estados vibracionales. [1]
En la fluorescencia, la especie se excita primero, al absorber un fotón , desde su estado electrónico fundamental a uno de los diversos estados vibracionales en el estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas hacen que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más bajo desde el estado electrónico excitado. Este proceso a menudo se visualiza con un diagrama de Jablonski . [1]
La molécula desciende entonces a uno de los distintos niveles vibracionales del estado electrónico fundamental, emitiendo un fotón en el proceso. [1] Como las moléculas pueden descender a cualquiera de los distintos niveles vibracionales del estado fundamental, los fotones emitidos tendrán energías diferentes y, por lo tanto, frecuencias diferentes. Por lo tanto, al analizar las distintas frecuencias de luz emitidas en la espectroscopia de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los distintos niveles vibracionales.
En el caso de las especies atómicas, el proceso es similar; sin embargo, dado que las especies atómicas no tienen niveles de energía vibracional, los fotones emitidos suelen tener la misma longitud de onda que la radiación incidente. Este proceso de reemisión del fotón absorbido se denomina "fluorescencia de resonancia" y, si bien es característico de la fluorescencia atómica, también se observa en la fluorescencia molecular. [2]
En una medición de fluorescencia (emisión) típica, la longitud de onda de excitación es fija y la longitud de onda de detección varía, mientras que en una medición de excitación de fluorescencia la longitud de onda de detección es fija y la longitud de onda de excitación varía a lo largo de una región de interés. Un mapa de emisión se mide registrando los espectros de emisión resultantes de un rango de longitudes de onda de excitación y combinándolos todos juntos. Se trata de un conjunto de datos de superficie tridimensionales: intensidad de emisión en función de las longitudes de onda de excitación y emisión, y normalmente se representa como un mapa de contorno.
Existen dos tipos generales de instrumentos: fluorómetros de filtro , que utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente , y espectrofluorómetros , que utilizan monocromadores de rejilla de difracción para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
Ambos tipos utilizan el siguiente esquema: la luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador y llega a la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra y algunas de las moléculas de la muestra emiten fluorescencia. La luz fluorescente se emite en todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, que suele estar situado a 90° del haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente transmitida o reflejada llegue al detector.
Se pueden utilizar diversas fuentes de luz como fuentes de excitación, entre ellas láseres, LED y lámparas; en particular, arcos de xenón y lámparas de vapor de mercurio . Un láser solo emite luz de alta irradiancia en un intervalo de longitud de onda muy estrecho, normalmente inferior a 0,01 nm, lo que hace innecesario un monocromador o filtro de excitación. La desventaja de este método es que la longitud de onda de un láser no se puede modificar mucho. Una lámpara de vapor de mercurio es una lámpara de línea, lo que significa que emite luz cerca de las longitudes de onda pico. Por el contrario, un arco de xenón tiene un espectro de emisión continuo con una intensidad casi constante en el rango de 300 a 800 nm y una irradiancia suficiente para realizar mediciones hasta justo por encima de los 200 nm.
En los fluorímetros se pueden utilizar filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite luz de una longitud de onda ajustable con una tolerancia ajustable. El tipo más común de monocromador utiliza una rejilla de difracción, es decir, la luz colimada ilumina una rejilla y sale con un ángulo diferente según la longitud de onda. El monocromador se puede ajustar para seleccionar qué longitudes de onda transmitir. Para permitir mediciones de anisotropía, es necesario agregar dos filtros de polarización: uno después del monocromador o filtro de excitación y otro antes del monocromador o filtro de emisión.
Como se mencionó anteriormente, la fluorescencia se mide con mayor frecuencia en un ángulo de 90° con respecto a la luz de excitación. Esta geometría se utiliza en lugar de colocar el sensor en la línea de la luz de excitación en un ángulo de 180° para evitar la interferencia de la luz de excitación transmitida. Ningún monocromador es perfecto y transmitirá algo de luz parásita , es decir, luz con longitudes de onda diferentes a las deseadas. Un monocromador ideal solo transmitiría luz en el rango especificado y tendría una alta transmisión independiente de la longitud de onda. Al medir en un ángulo de 90°, solo la luz dispersada por la muestra causa luz parásita. Esto da como resultado una mejor relación señal-ruido y reduce el límite de detección en aproximadamente un factor de 10000, [3] en comparación con la geometría de 180°. Además, la fluorescencia también se puede medir desde el frente, lo que a menudo se hace para muestras turbias u opacas. [4]
El detector puede ser monocanal o multicanal. El detector monocanal solo puede detectar la intensidad de una longitud de onda a la vez, mientras que el multicanal detecta la intensidad de todas las longitudes de onda simultáneamente, lo que hace innecesario el monocromador de emisión o el filtro.
Los fluorímetros más versátiles con monocromadores duales y una fuente de luz de excitación continua pueden registrar tanto un espectro de excitación como un espectro de fluorescencia. Al medir espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitación se mantiene constante, preferiblemente a una longitud de onda de alta absorción, y el monocromador de emisión escanea el espectro. Para medir espectros de excitación, la longitud de onda que pasa a través del filtro de emisión o monocromador se mantiene constante y el monocromador de excitación escanea. El espectro de excitación generalmente es idéntico al espectro de absorción ya que la intensidad de fluorescencia es proporcional a la absorción. [5]
En concentraciones bajas, la intensidad de fluorescencia generalmente será proporcional a la concentración del fluoróforo .
A diferencia de la espectroscopia UV/visible, los espectros "estándar" independientes del dispositivo no se obtienen fácilmente. Varios factores influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para obtener espectros "verdaderos", es decir, independientes de la máquina. Aquí se clasificarán los diferentes tipos de distorsiones como relacionadas con el instrumento o con la muestra. En primer lugar, se analiza la distorsión que surge del instrumento. Para empezar, la intensidad de la fuente de luz y las características de la longitud de onda varían con el tiempo durante cada experimento y entre cada experimento. Además, ninguna lámpara tiene una intensidad constante en todas las longitudes de onda. Para corregir esto, se puede aplicar un divisor de haz después del monocromador de excitación o un filtro para dirigir una parte de la luz a un detector de referencia.
Además, hay que tener en cuenta la eficiencia de transmisión de los monocromadores y filtros, que también pueden cambiar con el tiempo. La eficiencia de transmisión del monocromador también varía en función de la longitud de onda, por lo que se debe colocar un detector de referencia opcional después del monocromador o filtro de excitación. El porcentaje de fluorescencia captada por el detector también depende del sistema. Además, la eficiencia cuántica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, varía entre distintos detectores, con la longitud de onda y con el tiempo, ya que el detector inevitablemente se deteriora.
Otros dos temas que deben tenerse en cuenta son la óptica utilizada para dirigir la radiación y los medios para sujetar o contener el material de muestra (denominado cubeta o celda). Para la mayoría de las mediciones de UV, visible y NIR, es necesario el uso de cubetas de cuarzo de precisión. En ambos casos, es importante seleccionar materiales que tengan una absorción relativamente baja en el rango de longitud de onda de interés. El cuarzo es ideal porque transmite desde 200 nm a 2500 nm; el cuarzo de mayor calidad puede incluso transmitir hasta 3500 nm, mientras que las propiedades de absorción de otros materiales pueden enmascarar la fluorescencia de la muestra.
La corrección de todos estos factores instrumentales para obtener un espectro "estándar" es un proceso tedioso, que sólo se aplica en la práctica cuando es estrictamente necesario. Este es el caso, por ejemplo, de la medición del rendimiento cuántico o de la búsqueda de la longitud de onda con la intensidad de emisión más alta.
Como se mencionó anteriormente, las distorsiones también surgen de la muestra. Por lo tanto, también se deben tener en cuenta algunos aspectos de la muestra. En primer lugar, la fotodescomposición puede disminuir la intensidad de la fluorescencia con el tiempo. También se debe tener en cuenta la dispersión de la luz. Los tipos de dispersión más significativos en este contexto son la dispersión Rayleigh y Raman. La luz dispersada por dispersión Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersión Raman la luz dispersada cambia de longitud de onda generalmente a longitudes de onda más largas. La dispersión Raman es el resultado de un estado electrónico virtual inducido por la luz de excitación. Desde este estado virtual , las moléculas pueden relajarse de nuevo a un nivel vibracional distinto del estado fundamental vibracional. [7] En los espectros de fluorescencia, siempre se ve en una diferencia de número de onda constante en relación con el número de onda de excitación, por ejemplo, el pico aparece en un número de onda 3600 cm −1 más bajo que la luz de excitación en el agua.
Otros aspectos a considerar son los efectos de filtro interno. [8] [9] Entre ellos se encuentra la reabsorción. La reabsorción ocurre porque otra molécula o parte de una macromolécula absorbe en las longitudes de onda en las que el fluoróforo emite radiación. Si este es el caso, algunos o todos los fotones emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidos nuevamente. Otro efecto de filtro interno ocurre debido a altas concentraciones de moléculas absorbentes, incluido el fluoróforo. El resultado es que la intensidad de la luz de excitación no es constante en toda la solución. En consecuencia, solo un pequeño porcentaje de la luz de excitación alcanza los fluoróforos que son visibles para el sistema de detección. Los efectos de filtro interno cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por lo tanto, deben considerarse al analizar el espectro de emisión de la luz fluorescente. [5] [10]
La fluorescencia de una proteína plegada es una mezcla de la fluorescencia de residuos aromáticos individuales. La mayoría de las emisiones de fluorescencia intrínsecas de una proteína plegada se deben a la excitación de residuos de triptófano , con algunas emisiones debidas a tirosina y fenilalanina; pero los enlaces disulfuro también tienen una absorción apreciable en este rango de longitud de onda. Típicamente, el triptófano tiene una longitud de onda de absorción máxima de 280 nm y un pico de emisión que es solvatocrómico , que varía de ca. 300 a 350 nm dependiendo de la polaridad del entorno local [11] Por lo tanto, la fluorescencia de la proteína puede usarse como un diagnóstico del estado conformacional de una proteína. [12] Además, la fluorescencia del triptófano está fuertemente influenciada por la proximidad de otros residuos ( es decir , los grupos protonados cercanos como Asp o Glu pueden causar la extinción de la fluorescencia de Trp). Además, es posible la transferencia de energía entre el triptófano y los demás aminoácidos fluorescentes, lo que afectaría al análisis, especialmente en los casos en los que se adopta el enfoque ácido de Förster. Además, el triptófano es un aminoácido relativamente raro; muchas proteínas contienen solo uno o unos pocos residuos de triptófano. Por lo tanto, la fluorescencia del triptófano puede ser una medida muy sensible del estado conformacional de los residuos de triptófano individuales. La ventaja en comparación con las sondas extrínsecas es que la proteína en sí no se modifica. El uso de la fluorescencia intrínseca para el estudio de la conformación de las proteínas se limita en la práctica a los casos con pocos (o quizás solo un) residuos de triptófano, ya que cada uno experimenta un entorno local diferente, lo que da lugar a diferentes espectros de emisión.
El triptófano es un importante fluorescente intrínseco (aminoácido), que puede utilizarse para estimar la naturaleza del microambiente del triptófano. Al realizar experimentos con desnaturalizantes, surfactantes u otras moléculas anfifílicas , el microambiente del triptófano puede cambiar. Por ejemplo, si una proteína que contiene un solo triptófano en su núcleo "hidrofóbico" se desnaturaliza con el aumento de la temperatura, aparecerá un espectro de emisión desplazado hacia el rojo. Esto se debe a la exposición del triptófano a un entorno acuoso en lugar de un interior proteico hidrofóbico. Por el contrario, la adición de un surfactante a una proteína que contiene un triptófano que está expuesto al disolvente acuoso provocará un espectro de emisión desplazado hacia el azul si el triptófano está incrustado en la vesícula o micela del surfactante . [13] Las proteínas que carecen de triptófano pueden estar acopladas a un fluoróforo .
Con excitación de fluorescencia a 295 nm, el espectro de emisión de triptófano es dominante sobre la fluorescencia más débil de tirosina y fenilalanina .
La espectroscopia de fluorescencia se utiliza, entre otros, en los campos de investigación bioquímica, médica y química para analizar compuestos orgánicos . También se ha informado de su uso para diferenciar tumores malignos de la piel de benignos.
Las técnicas de espectroscopia de fluorescencia atómica (AFS) son útiles en otros tipos de análisis/medición de un compuesto presente en el aire o el agua, u otros medios, como CVAFS , que se utiliza para la detección de metales pesados, como el mercurio.
La fluorescencia también se puede utilizar para redirigir fotones, véase colector solar fluorescente.
Además, la espectroscopia de fluorescencia se puede adaptar al nivel microscópico utilizando microfluorimetría.
En química analítica, los detectores de fluorescencia se utilizan con HPLC .
En el campo de la investigación del agua, la espectroscopia de fluorescencia se puede utilizar para monitorear la calidad del agua mediante la detección de contaminantes orgánicos. [14] Los avances recientes en informática y aprendizaje automático incluso han permitido detectar la contaminación bacteriana del agua. [15]
En la investigación biomédica, la espectroscopia de fluorescencia se utiliza para evaluar la eficiencia de la distribución de fármacos a través de la reticulación de agentes fluorescentes con diversos fármacos. [16]
La espectroscopia de fluorescencia en la investigación biofísica permite a las personas visualizar y caracterizar los dominios lipídicos dentro de las membranas celulares. [17]