El primer aislamiento del ácido desoxirribonucleico (ADN) fue realizado en 1869 por Friedrich Miescher . [1] La extracción de ADN es el proceso de aislar ADN de las células de un organismo aislado de una muestra, generalmente una muestra biológica como sangre, saliva o tejido. Implica abrir las células, eliminar proteínas y otros contaminantes y purificar el ADN para que esté libre de otros componentes celulares. El ADN purificado se puede utilizar luego para aplicaciones posteriores, como PCR , [2] secuenciación o clonación . Actualmente, es un procedimiento rutinario en biología molecular o análisis forenses .
Este proceso se puede realizar de varias maneras, dependiendo del tipo de muestra y la aplicación posterior, [3] los métodos más comunes son: lisis mecánica, química y enzimática, precipitación, purificación y concentración. El método específico utilizado para extraer el ADN, como la extracción con fenol-cloroformo, la precipitación con alcohol o la purificación a base de sílice. [4]
Para el método químico, se utilizan muchos kits diferentes para la extracción, y seleccionar el correcto ahorrará tiempo en la optimización del kit y en los procedimientos de extracción. Se considera que la detección de sensibilidad por PCR muestra la variación entre los kits comerciales. [5]
Existen muchos métodos diferentes para extraer ADN, pero algunos pasos comunes incluyen:
Vale la pena señalar que se pueden utilizar algunas variaciones de estos pasos según el protocolo de extracción de ADN específico. Además, hay algunos kits disponibles comercialmente que incluyen reactivos y protocolos diseñados específicamente para un tipo específico de muestra. [6]
La extracción de ADN es frecuentemente un paso preliminar en muchos procedimientos de diagnóstico utilizados para identificar virus y bacterias ambientales y diagnosticar enfermedades y dolencias hereditarias. Estos métodos consisten, entre otros, en:
La técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) se desarrolló en la década de 1980. La idea básica es utilizar una sonda de ácido nucleico para hibridar ADN nuclear de células en interfase o de cromosomas en metafase adheridos a un portaobjetos microscópico. Es un método molecular que se utiliza, entre otras cosas, para reconocer y contar grupos bacterianos concretos. [1]
Para reconocer, definir y cuantificar los patrones geográficos y temporales en las comunidades de bacterioplancton marino, los investigadores emplean una técnica llamada polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP).
Secuenciación: Genomas completos o parciales y otros componentes cromosómicos, terminados para comparar con secuencias publicadas previamente.
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Las proteínas celulares e histonas unidas al ADN se pueden eliminar añadiendo una proteasa o precipitando las proteínas con acetato de sodio o amonio o extrayéndolas con una mezcla de fenol-cloroformo antes de la precipitación del ADN.
Después del aislamiento, el ADN se disuelve en un tampón ligeramente alcalino, normalmente en un tampón TE , o en agua ultrapura .
Los productos químicos más comunes utilizados para la extracción de ADN incluyen:
Algunos de los métodos de extracción de ADN más comunes incluyen la extracción orgánica , la extracción Chelex y la extracción en fase sólida . [8] Estos métodos producen consistentemente ADN aislado, pero difieren tanto en la calidad como en la cantidad de ADN obtenido. Al seleccionar un método de extracción de ADN, hay múltiples factores a considerar, incluidos el costo, el tiempo, la seguridad y el riesgo de contaminación.
La extracción orgánica implica la adición de incubación en múltiples soluciones químicas diferentes; [8] que incluye un paso de lisis , una extracción con fenol-cloroformo, una precipitación con etanol y pasos de lavado. La extracción orgánica se utiliza a menudo en los laboratorios porque es barata y produce grandes cantidades de ADN puro. Aunque es fácil, hay muchos pasos a seguir y lleva más tiempo que otros métodos. También implica el uso desfavorable de los químicos tóxicos fenol y cloroformo , y existe un mayor riesgo de contaminación debido a la transferencia de ADN entre múltiples tubos. [9] Hace décadas se desarrollaron eficazmente varios protocolos basados en la extracción orgánica de ADN, [10] aunque en los últimos años también se han desarrollado y publicado versiones mejoradas y más prácticas de estos protocolos. [11]
El método de extracción de chelex implica agregar la resina Chelex a la muestra, hervir la solución y luego agitarla y centrifugarla. Los materiales celulares se unen a las perlas Chelex, mientras que el ADN está disponible en el sobrenadante . [9] El método Chelex es mucho más rápido y simple que la extracción orgánica, y solo requiere un tubo, lo que disminuye el riesgo de contaminación del ADN. Desafortunadamente, la extracción con Chelex no produce tanta cantidad y el ADN obtenido es monocatenario, lo que significa que solo puede usarse para análisis basados en PCR y no para RFLP . [9]
La extracción en fase sólida , como el uso de un método de extracción basado en columna de centrifugación, aprovecha el hecho de que el ADN se une a la sílice . La muestra que contiene ADN se añade a una columna que contiene gel de sílice o perlas de sílice y sales caotrópicas . Las sales caotrópicas interrumpen los enlaces de hidrógeno entre las hebras y facilitan la unión del ADN a la sílice al hacer que los ácidos nucleicos se vuelvan hidrófobos. Esto expone los residuos de fosfato para que estén disponibles para la adsorción. [12] El ADN se une a la sílice, mientras que el resto de la solución se lava con etanol para eliminar las sales caotrópicas y otros componentes innecesarios. [8] Luego, el ADN se puede rehidratar con soluciones acuosas bajas en sal que permitan la elución del ADN de las perlas.
Este método produce ADN de alta calidad, en gran parte bicatenario, que puede utilizarse tanto para análisis de PCR como de RFLP . Este procedimiento puede automatizarse [9] y tiene un alto rendimiento, aunque menor que el método de fenol-cloroformo . Este es un método de un solo paso, es decir, todo el procedimiento se completa en un solo tubo. Esto reduce el riesgo de contaminación, lo que lo hace muy útil para la extracción forense de ADN. Diferentes empresas fabrican y comercializan múltiples kits comerciales de extracción en fase sólida; el único problema es que son más caros que la extracción orgánica o la extracción Chelex.
Se deben elegir técnicas específicas para el aislamiento de ADN de algunas muestras. Las muestras típicas con aislamiento de ADN complicado son:
El ADN extracromosómico es generalmente fácil de aislar, especialmente los plásmidos pueden aislarse fácilmente mediante lisis celular seguida de precipitación de proteínas, que atrapa el ADN cromosómico en una fracción insoluble y, después de la centrifugación, el ADN plasmídico puede purificarse a partir de una fracción soluble.
Una extracción de ADN de Hirt es un aislamiento de todo el ADN extracromosómico en una célula de mamífero. El proceso de extracción de Hirt elimina el ADN nuclear de alto peso molecular, dejando solo ADN mitocondrial de bajo peso molecular y cualquier episoma viral presente en la célula.
Un indicador de difenilamina (DPA) confirmará la presencia de ADN. Este procedimiento implica la hidrólisis química del ADN: cuando se calienta (por ejemplo, ≥95 °C) en ácido, la reacción requiere un azúcar desoxirribosa y, por lo tanto, es específica del ADN. En estas condiciones, la 2-desoxirribosa se convierte en w-hidroxilevulinil aldehído, que reacciona con el compuesto difenilamina para producir un compuesto de color azul. La concentración de ADN se puede determinar midiendo la intensidad de absorbancia de la solución a 600 nm con un espectrofotómetro y comparándola con una curva estándar de concentraciones de ADN conocidas.
Como medida de la pureza del ADN se utiliza la medición de la intensidad de absorbancia de la solución de ADN a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm . El ADN se puede cuantificar cortando el ADN con una enzima de restricción , ejecutándolo en un gel de agarosa , tiñendo con bromuro de etidio (EtBr) o una tinción diferente y comparando la intensidad del ADN con un marcador de ADN de concentración conocida.
Utilizando la técnica de transferencia Southern , este ADN cuantificado se puede aislar y examinar más a fondo mediante análisis de PCR y RFLP . Estos procedimientos permiten la diferenciación de las secuencias repetidas dentro del genoma. Son estas técnicas las que los científicos forenses utilizan para comparar, identificar y analizar.
En este método, los núcleos de las plantas se aíslan triturando físicamente los tejidos y reconstituyendo los núcleos intactos en un tampón de aislamiento nuclear (NIB) único. Los ADN de los plástidos se liberan de los orgánulos y se eliminan con un tampón osmótico mediante lavado y centrifugación. Luego, los núcleos purificados se lisan y se limpian adicionalmente mediante extracción orgánica, y el ADN genómico se precipita con una alta concentración de CTAB. El ADNg de alta pureza y alto peso molecular se extrae de los núcleos y se disuelve en un tampón de alto pH, lo que permite un almacenamiento estable a largo plazo. [14]
El almacenamiento de ADN es un aspecto importante de los proyectos de extracción de ADN, ya que garantiza la integridad y estabilidad del ADN extraído para aplicaciones posteriores. [15]
Un método común de almacenamiento de ADN es la precipitación con etanol, que implica agregar etanol y una sal, como cloruro de sodio o acetato de potasio, al ADN extraído para precipitarlo fuera de la solución. Luego, el ADN se sedimenta mediante centrifugación y se lava con etanol al 70% para eliminar cualquier contaminante restante. Luego, el sedimento de ADN se seca al aire y se resuspende en un tampón, como el tampón Tris-EDTA (TE), para su almacenamiento.
Otro método es congelar el ADN en un tampón como el tampón TE, o en un crioprotector como el glicerol o DMSO, a -20 o -80 grados Celsius. Este método preserva la integridad del ADN y ralentiza la actividad de cualquier enzima que pueda degradarlo.
Es importante tener en cuenta que la elección del tampón de almacenamiento y las condiciones dependerán de la aplicación posterior para la que se destina el ADN. Por ejemplo, si el ADN se va a utilizar para PCR, se puede almacenar en tampón TE a 4 grados Celsius, mientras que si se va a utilizar para almacenamiento o envío a largo plazo, se puede almacenar en etanol a -20 grados. Celsius. El ADN extraído debe comprobarse periódicamente para determinar su calidad e integridad, por ejemplo mediante electroforesis en gel o espectrofotometría. También se deben observar y controlar las condiciones de almacenamiento, como la temperatura y la humedad.
También es importante considerar la estabilidad a largo plazo del ADN y el potencial de degradación con el tiempo. El ADN extraído debe almacenarse durante el menor tiempo posible y las condiciones de almacenamiento deben elegirse para minimizar el riesgo de degradación.
En general, el ADN extraído debe almacenarse en las mejores condiciones posibles para garantizar su estabilidad e integridad para aplicaciones posteriores.
Existen varias técnicas de control de calidad que se utilizan para garantizar la calidad del ADN extraído, entre ellas: [16]
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