La electroforesis de proteínas es un método para analizar las proteínas en un fluido o un extracto. La electroforesis se puede realizar con un pequeño volumen de muestra de varias formas alternativas con o sin un medio de soporte, a saber, agarosa o poliacrilamida . Las variantes de la electroforesis en gel incluyen SDS-PAGE , electroforesis de flujo libre , electroenfoque , isotacoforesis , electroforesis de afinidad , inmunoelectroforesis , contraelectroforesis y electroforesis capilar . Cada variante tiene muchos subtipos con ventajas y limitaciones individuales. La electroforesis en gel a menudo se realiza en combinación con electrotransferencia o inmunotransferencia para brindar información adicional sobre una proteína específica. [1]
La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE ) describe un conjunto de técnicas relacionadas para separar proteínas según su movilidad electroforética (una función del peso molecular de una cadena polipeptídica) mientras se encuentran en estado desnaturalizado (desplegado). En la mayoría de las proteínas, la unión de SDS a la cadena polipeptídica imparte una distribución uniforme de la carga por unidad de masa, lo que da como resultado un fraccionamiento por tamaño aproximado durante la electroforesis. [2]
El SDS es un detergente potente que se utiliza para desnaturalizar las proteínas nativas y convertirlas en polipéptidos individuales desplegados . Cuando una mezcla de proteínas se calienta a 100 °C en presencia de SDS, el detergente envuelve la estructura principal del polipéptido. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven insignificantes en comparación con las cargas negativas aportadas por el SDS. Por lo tanto, los polipéptidos después del tratamiento se convierten en estructuras similares a varillas que poseen una densidad de carga uniforme, es decir, la misma carga negativa neta por unidad de longitud. Las movilidades electroforéticas de estas proteínas serán una función lineal de los logaritmos de sus pesos moleculares. [3]
Los geles nativos, también conocidos como geles no desnaturalizantes, analizan proteínas que aún se encuentran en su estado plegado. Por lo tanto, la movilidad electroforética depende no solo de la relación carga-masa, sino también de la forma física y el tamaño de la proteína. [4]
La BN-PAGE es una técnica PAGE nativa, donde el colorante azul brillante de Coomassie proporciona las cargas necesarias a los complejos proteicos para la separación electroforética. [5] [6] La desventaja de Coomassie es que al unirse a las proteínas puede actuar como un detergente provocando que los complejos se disocien . Otro inconveniente es la posible extinción de la quimioluminiscencia (por ejemplo, en la detección posterior mediante transferencia Western o en ensayos de actividad) o la fluorescencia de proteínas con grupos prostéticos (por ejemplo, hemo o clorofila ) o marcadas con colorantes fluorescentes. [ cita requerida ]
La CN-PAGE (comúnmente denominada Native PAGE) separa las proteínas de membrana y las solubles en agua ácidas en un gel de gradiente de poliacrilamida . No utiliza colorante cargado, por lo que la movilidad electroforética de las proteínas en la CN-PAGE (a diferencia de la técnica de cambio de carga BN-PAGE) está relacionada con la carga intrínseca de las proteínas. [7] La distancia de migración depende de la carga de la proteína, su tamaño y el tamaño de poro del gel. En muchos casos, este método tiene una resolución menor que la BN-PAGE, pero la CN-PAGE ofrece ventajas siempre que el colorante Coomassie interfiera con otras técnicas analíticas; por ejemplo, se ha descrito como una técnica de separación a microescala muy eficiente para los análisis FRET . [8] Además, como la CN-PAGE no requiere las duras condiciones de la BN-PAGE, puede retener los ensamblajes supramoleculares de complejos de proteínas de membrana que se disociarían en la BN-PAGE. [7]
Los complejos proteicos plegados de interés se separan de forma limpia y predecible sin riesgo de desnaturalización debido a las propiedades específicas del gel de poliacrilamida, la solución tampón de electroforesis, el equipo electroforético y los parámetros estandarizados utilizados. Las proteínas separadas se eluyen continuamente en un eluyente fisiológico y se transportan a un colector de fracciones. En cuatro a cinco fracciones de PAGE cada una, los diferentes cofactores metálicos se pueden identificar y cuantificar absolutamente mediante ICP-MS de alta resolución . Las estructuras asociadas de las metaloproteínas aisladas en estas fracciones se pueden determinar específicamente mediante espectroscopia de RMN en solución . [9]
La mayoría de las separaciones de proteínas se realizan utilizando un sistema de tampón "discontinuo" (o DISC) que mejora significativamente la nitidez de las bandas dentro del gel. Durante la electroforesis en un sistema de gel discontinuo, se forma un gradiente de iones en la etapa temprana de la electroforesis que hace que todas las proteínas se enfoquen en una única banda nítida. La formación del gradiente de iones se logra eligiendo un valor de pH en el que los iones del tampón solo estén moderadamente cargados en comparación con las proteínas recubiertas de SDS. Estas condiciones proporcionan un entorno en el que las reacciones de Kohlrausch determinan la conductividad molar . Como resultado, las proteínas recubiertas de SDS se concentran varias veces en una zona delgada del orden de 19 μm en unos pocos minutos. En esta etapa, todas las proteínas migran a la misma velocidad de migración por isotacoforesis . Esto ocurre en una región del gel que tiene poros más grandes para que la matriz del gel no retrase la migración durante el evento de enfoque o "apilamiento". [10] [11] La separación de las proteínas por tamaño se logra en la región inferior del gel, la "resolutiva". El gel de resolución normalmente tiene un tamaño de poro mucho menor, lo que produce un efecto de tamizado que ahora determina la movilidad electroforética de las proteínas. Al mismo tiempo, la parte de separación del gel también tiene un valor de pH en el que los iones del tampón tienen, en promedio, una carga mayor, lo que hace que "superen" a las proteínas cubiertas de SDS y eliminen el gradiente iónico y, por lo tanto, el efecto de apilamiento. [ cita requerida ]
Un sistema de tampón discontinuo muy extendido es el sistema tris-glicina o " Laemmli ", que se apila a un pH de 6,8 y se resuelve a un pH de ~8,3-9,0. Un inconveniente de este sistema es que estos valores de pH pueden promover la formación de enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína en las proteínas porque el pKa de la cisteína varía de 8 a 9 y porque el agente reductor presente en el tampón de carga no co-migra con las proteínas. Los avances recientes en la tecnología de tampón alivian este problema al resolver las proteínas a un pH muy inferior al pKa de la cisteína (p. ej., bis-tris , pH 6,5) e incluyen agentes reductores (p. ej. bisulfito de sodio) que se mueven hacia el gel antes que las proteínas para mantener un entorno reductor. Un beneficio adicional de utilizar tampones con valores de pH más bajos es que el gel de acrilamida es más estable a valores de pH más bajos, por lo que los geles se pueden almacenar durante largos períodos de tiempo antes de su uso. [12] [13]
A medida que se aplica voltaje, los aniones (y las moléculas de muestra cargadas negativamente) migran hacia el electrodo positivo (ánodo) en la cámara inferior, el ion líder es Cl − (alta movilidad y alta concentración); el glicinato es el ion final (baja movilidad y baja concentración). Las partículas de proteína SDS no migran libremente en el límite entre el Cl − del tampón de gel y el Gly − del tampón de cátodo. Friedrich Kohlrausch descubrió que la ley de Ohm también se aplica a los electrolitos disueltos . Debido a la caída de voltaje entre los tampones Cl − y glicina, las proteínas se comprimen (apilan) en capas delgadas micrométricas. [14] El límite se mueve a través de un gradiente de poros y la pila de proteínas se dispersa gradualmente debido a un aumento de la resistencia por fricción de la matriz de gel. El apilamiento y desapilamiento ocurre continuamente en el gel de gradiente, para cada proteína en una posición diferente. Para que la proteína se desacumule por completo, la concentración del gel de poliacrilamida debe ser superior al 16 % T. El sistema de dos geles de "Laemmli" es un gel de gradiente simple. La discontinuidad del pH de los tampones no tiene importancia para la calidad de la separación y no se necesita un "gel de apilamiento" con un pH diferente. [15]
El colorante de proteínas más popular es el azul brillante de Coomassie . Es un colorante aniónico que se une de forma no específica a las proteínas. Las proteínas en el gel se fijan con ácido acético y se tiñen simultáneamente. El exceso de colorante incorporado al gel se puede eliminar decolorando con la misma solución sin el colorante. Las proteínas se detectan como bandas azules sobre un fondo transparente. [16] [17]
Cuando se necesita un método más sensible que la tinción con Coomassie, se suele utilizar la tinción con plata. La tinción con plata es un procedimiento sensible para detectar trazas de proteínas en geles, pero también permite visualizar ácidos nucleicos o polisacáridos. [17]
En el mercado se encuentran disponibles métodos de visualización sin utilizar colorantes como Coomassie y plata. [18] Por ejemplo, Bio-Rad Laboratories comercializa geles “sin colorantes” para la electroforesis en gel SDS-PAGE. Como alternativa, se pueden utilizar colorantes fluorescentes reversibles, como los de Azure Biosystems, como AzureRed o Azure TotalStain Q. [17] [18] [19]
De manera similar a la electroforesis en gel de ácidos nucleicos, a menudo se utiliza un colorante de rastreo . Los colorantes aniónicos de una movilidad electroforética conocida suelen incluirse en el tampón de muestra. Un colorante de rastreo muy común es el azul de bromofenol . Este colorante se colorea a pH alcalino y neutro y es una pequeña molécula con carga negativa que se mueve hacia el ánodo. Al ser una molécula muy móvil, se mueve por delante de la mayoría de las proteínas. [20]
En medicina , la electroforesis de proteínas es un método de análisis de proteínas, principalmente en el suero sanguíneo . Antes del uso generalizado de la electroforesis en gel , la electroforesis de proteínas se realizaba como electroforesis de flujo libre (en papel) o como inmunoelectroforesis. [ cita requerida ]
Tradicionalmente, se consideran dos clases de proteínas sanguíneas : albúmina sérica y globulina . Generalmente son iguales en proporción, pero la albúmina como molécula es mucho más pequeña y tiene una carga negativa leve, lo que lleva a una acumulación de albúmina en el gel electroforético. Una pequeña banda antes de la albúmina representa la transtiretina (también llamada prealbúmina). Algunas formas de medicación o sustancias químicas corporales pueden causar su propia banda, pero generalmente es pequeña. Las bandas anormales (picos) se observan en la gammapatía monoclonal de significado incierto y el mieloma múltiple , y son útiles en el diagnóstico de estas afecciones. [ cita requerida ]
Las globulinas se clasifican según su patrón de bandas (con sus principales representantes): [ cita requerida ]