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Proteólisis paralela rápida

FASTpp (Proteolisis paralela rápida). Se distribuyen alícuotas de una mezcla de proteínas en varios tubos, que se exponen en paralelo a diferentes temperaturas y a una proteasa termoestable. La proteína restante se puede resolver en SDS-PAGE .

La proteólisis paralela rápida ( FASTpp ) es un método para determinar la termoestabilidad de las proteínas midiendo qué fracción de proteína resiste la digestión proteolítica rápida. [1]

Historia y antecedentes

La proteólisis se utiliza ampliamente en bioquímica y biología celular para investigar la estructura de las proteínas . [2] [3] En la "proteólisis limitada de tripsina", cantidades bajas de proteasa digieren proteínas tanto plegadas como desplegadas, pero a velocidades muy diferentes: las proteínas no estructuradas se cortan más rápidamente, mientras que las proteínas estructuradas se cortan a un ritmo más lento (a veces por órdenes de magnitud). Recientemente, se han propuesto varios otros ensayos de estabilidad de proteínas basados ​​en proteólisis, explotando otras proteasas con alta especificidad para escindir proteínas desplegadas. Estos incluyen proteólisis de pulso, [4] calorimetría de barrido proteolítico [5] y FASTpp.

Cómo funciona

FASTpp mide la cantidad de proteína que resiste la digestión en diversas condiciones. Para ello se utiliza una proteasa termoestable que escinde específicamente los restos hidrófobos expuestos . El ensayo FASTpp combina el despliegue térmico, la especificidad de una proteasa termoestable para la fracción desplegada con el poder de separación de SDS-PAGE . [6] Debido a esta combinación, FASTpp puede detectar cambios en la fracción plegada en un amplio rango físico-químico de condiciones que incluyen temperaturas de hasta 85 °C, pH 6–9, presencia o ausencia del proteoma completo . Las aplicaciones van desde la biotecnología hasta el estudio de mutaciones puntuales y ensayos de unión de ligandos .

Aplicaciones

FASTpp se ha utilizado para sondear: [1]

Tecnología

En primer lugar, se genera un lisado celular batiendo perlas de vidrio, homogeneización por presión o métodos de lisis química o física que no desnaturalizan la proteína de interés. (Opcionalmente para análisis dirigidos) se purifica una proteína de interés a partir de este lisado mediante métodos de afinidad basados ​​en etiquetas intrínsecamente desordenadas [12] u otras estrategias de purificación adecuadas, que a menudo implican varios pasos cromatográficos ortogonales.

Esta solución de proteína (total o purificada) se divide en alícuotas en varios tubos de una tira de PCR. Todas las alícuotas se exponen en paralelo en un ciclador de PCR de gradiente térmico a diferentes temperaturas máximas en presencia de la proteasa termoestable termolisina (ver figura). El control de temperatura automatizado se logra en un ciclador de gradiente térmico (comúnmente utilizado para PCR ). Los productos de la reacción se pueden separar mediante SDS-PAGE o Western Blot . [6] La proteasa termolisina puede ser completamente inactivada por EDTA . Esta característica de la termolisina hace que FASTpp sea compatible con la digestión posterior con tripsina , por ejemplo, para espectrometría de masas . [13] [14] [7]

Referencias

  1. ^ ab Minde, DP; Mauricio, MM; Rüdiger, SGD (2012). Uversky, Vladimir N (ed.). "Determinación de la estabilidad biofísica de las proteínas en lisados ​​mediante un ensayo de proteólisis rápida, FASTpp". MÁS UNO . 7 (10): e46147. Código Bib : 2012PLoSO...746147M. doi : 10.1371/journal.pone.0046147 . PMC  3463568 . PMID  23056252.
  2. ^ Johnson, DE; Xue, B.; Sickmeier, MD; Meng, J.; Cortese, MS; Oldfield, CJ; Le Gall, T.; Dunker, Alaska; Uversky, VN (2012). "Caracterización de alto rendimiento del desorden intrínseco en proteínas de la Iniciativa de Estructura de Proteínas". Revista de biología estructural . 180 (1): 201–215. doi :10.1016/j.jsb.2012.05.013. PMC 3578346 . PMID  22651963. 
  3. ^ Hoelen, H.; Kleizen, B.; Schmidt, A.; Richardson, J.; Charitou, P.; Thomas, PJ; Braakman, I. (2010). Uversky, Vladimir N (ed.). "El defecto de plegado primario y el rescate de ΔF508 CFTR emergen durante la traducción del dominio mutante". MÁS UNO . 5 (11): e15458. Código Bib : 2010PLoSO...515458H. doi : 10.1371/journal.pone.0015458 . PMC 2994901 . PMID  21152102. 
  4. ^ Parque, C.; Marqusee, S. (2005). "Proteolisis por pulsos: un método simple para la determinación cuantitativa de la estabilidad de las proteínas y la unión del ligando". Métodos de la naturaleza . 2 (3): 207–212. doi : 10.1038/nmeth740. PMID  15782190. S2CID  21364478.
  5. ^ Tur-Arlandis, G.; Rodríguez-Larrea, D.; Ibarra-Molero, B.; Sánchez-Ruiz, JM (2010). "Calorimetría de barrido proteolítico: una nueva metodología que investiga las características fundamentales de la estabilidad cinética de las proteínas". Revista Biofísica . 98 (6): L12-L14. Código Bib : 2010BpJ....98L..12T. doi :10.1016/j.bpj.2009.11.028. PMC 2849053 . PMID  20303845. 
  6. ^ ab Laemmli, Reino Unido (1970). "Escisión de proteínas estructurales durante el montaje de la cabeza del bacteriófago T4". Naturaleza . 227 (5259): 680–685. Código Bib :1970Natur.227..680L. doi :10.1038/227680a0. PMID  5432063. S2CID  3105149.
  7. ^ ab Leuenberger, P; Ganscha, S; Kahraman, A (2017). "El análisis de toda la célula del despliegue térmico de proteínas revela determinantes de la termoestabilidad". Ciencia . 355 (6327): eai7825. doi : 10.1126/ciencia.aai7825. PMID  28232526. S2CID  8432125.
  8. ^ Demarest, SJ; Martínez-Yamout, M.; Chung, J.; Chen, H.; Xu, W.; Dyson, HJ ; Evans, RM; Wright, PE (2002). "Plegamiento sinérgico mutuo en el reclutamiento de CBP/p300 por coactivadores del receptor nuclear p160". Naturaleza . 415 (6871): 549–553. doi :10.1038/415549a. PMID  11823864. S2CID  4423920.
  9. ^ ab Robaszkiewicz, K.; Ostrowska, Z.; Cyranka-Czaja, A.; Moraczewska, J. (2015). "La alteración de las interacciones tropomiosina-troponina reduce la activación del filamento fino de actina". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteínas y Proteómica . 1854 (5): 381–390. doi :10.1016/j.bbapap.2015.01.004. PMID  25603119.
  10. ^ Minde, DP; Anvarian, Z.; Rüdiger, SG; Mauricio, MM (2011). "Trastorno de desorden: ¿Cómo las mutaciones sin sentido en la proteína supresora de tumores APC conducen al cáncer?". Cáncer molecular . 10 : 101. doi : 10.1186/1476-4598-10-101 . PMC 3170638 . PMID  21859464. 
  11. ^ Tur-Arlandis, G.; Rodríguez-Larrea, D.; Ibarra-Molero, B.; Sánchez-Ruiz, JM (2010). "Calorimetría de barrido proteolítico: una nueva metodología que investiga las características fundamentales de la estabilidad cinética de las proteínas". Revista Biofísica . 98 (6): L12-L14. Código Bib : 2010BpJ....98L..12T. doi :10.1016/j.bpj.2009.11.028. PMC 2849053 . PMID  20303845. 
  12. ^ Minde, DP; Halff, EF; Bronceados, SJ (2013). "Diseñar desorden: Cuentos de colas inesperadas". Proteínas intrínsecamente desordenadas . 1 (1): e26790. doi :10.4161/idp.26790. PMC 5424805 . PMID  28516025. 
  13. ^ Chang, Y; Schlebach, JP; Verheul, RA; Parque, C (2012). "Enfoque proteómico simplificado para descubrir interacciones proteína-ligando". Ciencia de las proteínas . 21 (9): 1280–7. doi :10.1002/pro.2112. PMC 3631357 . PMID  22733688. 
  14. ^ Parque, C; Marquesee, S (2005). "Proteolisis por pulsos: un método simple para la determinación cuantitativa de la estabilidad de las proteínas y la unión del ligando". Métodos de la naturaleza . 2 (3): 207–12. doi : 10.1038/nmeth740. PMID  15782190. S2CID  21364478.