La dispersión de luz multiángulo ( MALS ) describe una técnica para medir la luz dispersada por una muestra en una pluralidad de ángulos. Se utiliza para determinar tanto la masa molar absoluta como el tamaño medio de las moléculas en solución , detectando cómo dispersan la luz . Lo más habitual es utilizar un haz colimado procedente de una fuente láser , en cuyo caso la técnica puede denominarse dispersión de luz láser multiángulo ( MALLS ). La inserción de la palabra láser tenía como objetivo tranquilizar a aquellos acostumbrados a realizar mediciones de dispersión de luz con fuentes de luz convencionales, como lámparas de arco de Hg, de que ahora se pueden realizar mediciones de ángulo bajo. [ cita necesaria ] Hasta la llegada de los láseres y sus finos haces asociados de ancho estrecho, el ancho de los haces de luz convencionales utilizados para realizar tales mediciones impedía la recopilación de datos en ángulos de dispersión más pequeños. En los últimos años, dado que todos los instrumentos comerciales de dispersión de luz utilizan fuentes láser, se ha eliminado la necesidad de mencionar la fuente de luz y se utiliza el término MALS en todo momento.
El término "multiángulo" se refiere a la detección de luz dispersada en diferentes ángulos discretos medida, por ejemplo, por un único detector movido en un rango que incluye los ángulos particulares seleccionados o una serie de detectores fijados en ubicaciones angulares específicas. Se presenta una discusión del fenómeno físico relacionado con esta dispersión de luz estática , incluidas algunas aplicaciones, métodos de análisis de datos y representaciones gráficas asociadas.
La medición de la luz dispersada de una muestra iluminada constituye la base de la llamada medición clásica de la dispersión de la luz . Históricamente, estas mediciones se realizaban utilizando un único detector [1] [2] que giraba formando un arco alrededor de la muestra iluminada. El primer instrumento comercial (formalmente llamado "fotómetro dispersado") fue el fotómetro de dispersión de luz Brice-Phoenix introducido a mediados de la década de 1950 y seguido por el fotómetro Sofica introducido a finales de la década de 1960.
Las mediciones generalmente se expresaron como intensidades dispersas o irradiancia dispersa. Dado que la recopilación de datos se realizó cuando el detector se colocó en diferentes ubicaciones del arco, correspondiendo cada posición a un ángulo de dispersión diferente, el concepto de colocar un detector separado en cada ubicación angular de interés [3] se entendió bien, aunque no implementado comercialmente [4] hasta finales de la década de 1970. Múltiples detectores que tienen diferente eficiencia cuántica tienen una respuesta diferente y, por lo tanto, deben normalizarse en este esquema. Brunsting y Mullaney [5] desarrollaron en 1974 un sistema interesante basado en el uso de películas de alta velocidad. Permitía registrar en la película toda la gama de intensidades dispersas y un barrido posterior del densitómetro proporcionaba las intensidades dispersas relativas. El uso entonces convencional de un solo detector que giraba alrededor de una muestra iluminada con intensidades recolectadas en ángulos específicos se llamaba dispersión diferencial de luz [6] después del término de la mecánica cuántica sección transversal diferencial , [7] σ(θ) expresado en milibarns/ estereorradián. Las mediciones de la sección transversal diferencial se realizaban habitualmente, por ejemplo, para estudiar la estructura del núcleo atómico mediante la dispersión de nucleones, [8] como los neutrones . Es importante distinguir entre dispersión de luz diferencial y dispersión de luz dinámica , ambas denominadas con las siglas DLS. Este último se refiere a una técnica muy diferente, que mide la fluctuación de la luz dispersada debido a interferencias constructivas y destructivas, estando vinculada la frecuencia al movimiento térmico, movimiento browniano de las moléculas o partículas en solución o suspensión.
Una medición MALS requiere un conjunto de elementos auxiliares. El más importante de ellos es un haz de luz colimado o enfocado (normalmente procedente de una fuente láser que produce un haz colimado de luz monocromática) que ilumina una región de la muestra. En los instrumentos modernos, el haz generalmente está polarizado en un plano perpendicular al plano de medición, aunque se pueden usar otras polarizaciones, especialmente cuando se estudian partículas anisotrópicas. Las mediciones anteriores, antes de la introducción de los láseres, se realizaban utilizando haces de luz enfocados, aunque no polarizados, procedentes de fuentes como lámparas de arco de Hg. [ cita necesaria ] Otro elemento requerido es una celda óptica para contener la muestra que se está midiendo. Alternativamente, se pueden emplear celdas que incorporen medios para permitir la medición de muestras en flujo. Si se van a medir las propiedades de dispersión de partículas individuales, se debe proporcionar un medio para introducir dichas partículas una por una a través del haz de luz en un punto generalmente equidistante de los detectores circundantes.
Aunque la mayoría de las mediciones basadas en MALS se realizan en un plano que contiene un conjunto de detectores generalmente colocados equidistantemente de una muestra ubicada centralmente a través de la cual pasa el haz de iluminación, también se han desarrollado versiones tridimensionales [9] [10] en las que los detectores se encuentran sobre la superficie de una esfera con la muestra controlada para que pase por su centro donde se cruza con la trayectoria del haz de luz incidente que pasa a lo largo de un diámetro de la esfera. El primer marco [9] se utiliza para medir partículas de aerosol, mientras que el segundo [10] se utiliza para examinar organismos marinos como el fitoplancton .
La medición tradicional de la dispersión diferencial de la luz era prácticamente idéntica a la técnica MALS utilizada actualmente. Aunque la técnica MALS generalmente recopila datos multiplexados de forma secuencial a partir de las salidas de un conjunto de detectores discretos, la medición anterior de dispersión diferencial de luz también recopilaba datos de forma secuencial a medida que un solo detector se movía de un ángulo de recolección al siguiente. Por supuesto, la implementación de MALS es mucho más rápida, pero se recopilan e interpretan los mismos tipos de datos de la misma manera. Por tanto, los dos términos se refieren al mismo concepto. Para mediciones de dispersión de luz diferencial, el fotómetro de dispersión de luz tiene un único detector, mientras que el fotómetro de dispersión de luz MALS generalmente tiene una pluralidad de detectores.
Otro tipo de dispositivo MALS fue desarrollado en 1974 por Salzmann et al. [11] basado en un detector de patrones de luz inventado por George et al. [12] para Litton Systems Inc. en 1971. El detector Litton fue desarrollado para muestrear la distribución de energía luminosa en el plano focal posterior de una lente esférica para muestrear relaciones geométricas y la distribución de densidad espectral de objetos registrados en transparencias de película.
La aplicación del detector Litton de Salzman et al. proporcionó mediciones en 32 pequeños ángulos de dispersión entre 0° y 30°, y promedió en una amplia gama de ángulos acimutales, ya que los ángulos más importantes son los ángulos delanteros para la dispersión de la luz estática. En 1980, Bartholi et al. [13] habían desarrollado un nuevo enfoque para medir la dispersión en ángulos de dispersión discretos mediante el uso de un reflector elíptico para permitir la medición en 30 ángulos polares en el rango 2,5° ≤ θ ≤ 177,5° con una resolución de 2,1°.
La comercialización de sistemas multiángulo comenzó en 1977 cuando Science Spectrum, Inc. [14] patentó un sistema capilar de flujo continuo para un sistema de bioensayo personalizado desarrollado para la USFDA . El primer instrumento MALS comercial que incorpora 8 detectores discretos fue entregado a SC Johnson and Son, por Wyatt Technology Company, en 1983, [15] seguido en 1984 con la venta del primer instrumento de flujo de 15 detectores (Dawn-F) [16] a AMOCO. En 1988, se introdujo una configuración tridimensional [9] específicamente para medir las propiedades de dispersión de partículas individuales de aerosol. Casi al mismo tiempo se construyó un dispositivo submarino para medir las propiedades de la luz dispersada de un solo fitoplancton. [10] Las señales se recogieron mediante fibras ópticas y se transmitieron a fotomultiplicadores individuales. Alrededor de diciembre de 2001 se comercializó un instrumento que mide 7 ángulos de dispersión utilizando un detector CCD (BI-MwA: Brookhaven Instruments Corp, Hotlsville, NY).
La literatura asociada con las mediciones realizadas con fotómetros MALS es extensa. [17] [18] tanto en referencia a mediciones por lotes de partículas/moléculas como a mediciones posteriores al fraccionamiento por medios cromatográficos, como la cromatografía de exclusión por tamaño [19] (SEC), la cromatografía de fase reversa [20] (RPC) y el fraccionamiento de flujo de campo [ 21] (FFF).
La interpretación de las mediciones de dispersión realizadas en ubicaciones multiangulares se basa en cierto conocimiento de las propiedades a priori de las partículas o moléculas medidas. Las características de dispersión de diferentes clases de tales dispersores pueden interpretarse mejor mediante la aplicación de una teoría apropiada. Por ejemplo, las siguientes teorías se aplican con mayor frecuencia.
La dispersión de Rayleigh es la más simple y describe la dispersión elástica de la luz u otra radiación electromagnética por objetos mucho más pequeños que la longitud de onda incidente. Este tipo de dispersión es responsable del color azul del cielo durante el día y es inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda.
La aproximación de Rayleigh-Gans es un medio para interpretar las mediciones MALS con el supuesto de que las partículas en dispersión tienen un índice de refracción, n 1 , muy cercano al índice de refracción del medio circundante, n 0 . Si establecemos m = n 1 /n 0 y asumimos que |m - 1| << 1 , entonces tales partículas pueden considerarse compuestas de elementos muy pequeños, cada uno de los cuales puede representarse como una partícula de dispersión de Rayleigh. Por tanto, se supone que cada elemento pequeño de la partícula más grande se dispersa independientemente de cualquier otro.
La teoría de Lorenz-Mie [22] se utiliza para interpretar la dispersión de la luz por partículas esféricas homogéneas. La aproximación de Rayleigh-Gans y la teoría de Lorenz-Mie producen resultados idénticos para esferas homogéneas en el límite como |1 − m | → 0 .
La teoría de Lorenz-Mie puede generalizarse a partículas esféricamente simétricas por referencia. [23] Erma ha tratado formas y estructuras más generales. [24]
Los datos de dispersión generalmente se representan en términos de la denominada relación de Rayleigh en exceso, definida como la relación de Rayleigh de la solución o evento de partícula única de la que se resta la relación de Rayleigh del propio fluido portador y otras contribuciones de fondo, si las hay. La relación de Rayleigh medida en un detector que forma un ángulo θ y subtiende un ángulo sólido ΔΩ se define como la intensidad de la luz por unidad de ángulo sólido por unidad de intensidad incidente, I 0 , por unidad de volumen de dispersión iluminada ΔV . El volumen de dispersión ΔV desde el cual la luz dispersa llega al detector está determinado por el campo de visión del detector generalmente restringido por aperturas, lentes y topes. Considere ahora una medición MALS realizada en un plano a partir de una suspensión de N partículas/moléculas idénticas por ml iluminadas por un fino haz de luz producido por un láser. Suponiendo que la luz está polarizada perpendicular al plano de los detectores. La intensidad de la luz dispersada medida por el detector en un ángulo θ superior a la dispersada por el fluido en suspensión sería
donde i(θ) es la función de dispersión [1] de una sola partícula, k = 2πn 0 /λ 0 , n 0 es el índice de refracción del fluido en suspensión y λ 0 es la longitud de onda de vacío de la luz incidente. El exceso de relación de Rayleigh, R(θ) , viene dado por
Incluso para una esfera homogénea simple de radio a cuyo índice de refracción, n, es casi el mismo que el índice de refracción "n 0 " del fluido en suspensión, es decir, la aproximación de Rayleigh-Gans, la función de dispersión en el plano de dispersión es relativamente compleja. cantidad
y λ 0 es la longitud de onda de la luz incidente en el vacío.
MALS se usa más comúnmente para la caracterización de la masa y el tamaño de moléculas en solución. Las primeras implementaciones de MALS, como las analizadas por Bruno H. Zimm en su artículo "Aparatos y métodos para la medición e interpretación de la variación angular de la dispersión de la luz; resultados preliminares en soluciones de poliestireno" [1] implicaban el uso de un solo detector que giraba alrededor de una muestra. contenido dentro de un recipiente transparente. Las mediciones MALS de muestras que no fluyen como ésta se denominan comúnmente "mediciones por lotes". Al crear muestras en varias concentraciones bajas conocidas y detectar luz dispersa sobre la muestra en diferentes ángulos, se puede crear un diagrama de Zimm [25] trazando: vs donde c es la concentración de la muestra y k es un factor de estiramiento usado para poner kc y en el mismo rango numérico.
Cuando se traza, se puede extrapolar tanto al ángulo cero como a la concentración cero, y el análisis del gráfico dará el radio cuadrático medio de las moléculas de muestra desde la pendiente inicial de la línea c=0 y la masa molar de la molécula en el punto donde ambos la concentración y el ángulo son iguales a cero. Las mejoras al gráfico de Zimm, que incorporan todos los datos recopilados (comúnmente denominado "ajuste global"), han reemplazado en gran medida al gráfico de Zimm en los análisis por lotes modernos. [26]
Con la llegada de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), las mediciones MALS comenzaron a usarse junto con un detector de concentración en línea para determinar la masa molar absoluta y el tamaño de las fracciones de muestra que eluyen de la columna, en lugar de depender de técnicas de calibración. Estas mediciones MALS en modo de flujo se han ampliado a otras técnicas de separación, como el fraccionamiento de flujo de campo , la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de fase inversa .
La dependencia angular de los datos de dispersión de la luz se muestra a continuación en una figura de una mezcla de esferas de poliestireno separadas por SEC. Las dos muestras más pequeñas (más a la derecha) eluyeron en último lugar y no muestran dependencia angular. La muestra, segunda a la derecha, muestra una variación angular lineal con la intensidad aumentando en ángulos de dispersión más bajos. La muestra más grande, a la izquierda, eluye primero y muestra una variación angular no lineal.
El acoplamiento de MALS con un detector de concentración en línea después de un medio de separación de muestras como SEC permite el cálculo de la masa molar de la muestra eluida además de su radio cuadrático medio. La siguiente figura representa una separación cromatográfica de agregados de BSA. Se muestran la señal de dispersión de luz de 90° de un detector MALS y los valores de masa molar para cada corte de elución.
Como MALS puede proporcionar la masa molar y el tamaño de las moléculas, permite estudiar la unión proteína-proteína, la oligomerización y la cinética de autoensamblaje, asociación y disociación. Al comparar la masa molar de una muestra con su concentración, se puede determinar la afinidad de unión y la estequiometría de las moléculas que interactúan.
La relación de ramificación de un polímero se relaciona con el número de unidades de ramificación en un polímero ramificado aleatoriamente y el número de brazos en polímeros ramificados en estrella y fue definida por Zimm y Stockmayer como
¿Dónde está el radio cuadrático medio de macromoléculas lineales y ramificadas con masas molares idénticas? [27] Al utilizar MALS junto con un detector de concentración como se describe anteriormente, se crea una gráfica log-log del radio cuadrático medio frente a la masa molar. La pendiente de esta gráfica produce la relación de ramificación, g. [28]
Además de la ramificación, la gráfica log-log de tamaño versus masa molar indica la forma o conformación de una macromolécula. Un aumento en la pendiente de la gráfica indica una variación en la conformación de un polímero desde esférico hasta espiral aleatorio y lineal. La combinación del radio cuadrático medio de MALS con el radio hidrodinámico obtenido de las mediciones DLS produce el factor de forma ρ = , para cada fracción de tamaño macromolecular.
Otras aplicaciones de MALS incluyen el dimensionamiento de nanopartículas , [29] [30] [31] estudios de agregación de proteínas , interacciones proteína-proteína , movilidad electroforética o potencial zeta. Se han adoptado técnicas MALS para el estudio de la estabilidad de fármacos y su uso en nanomedicina .
