Los factores que afectan la retención y separación de solutos en el sistema cromatográfico de fase reversa son los siguientes:
a. La naturaleza química de la fase estacionaria , es decir, los ligandos unidos en su superficie, así como su densidad de enlace, es decir, el grado de su cobertura.
b. La composición de la fase móvil . Tipo de solventes a granel cuyas mezclas afectan la polaridad de la fase móvil, de ahí el nombre modificador de un solvente agregado para afectar la polaridad de la fase móvil.
C. Los aditivos, como los tampones, afectan el pH de la fase móvil , lo que afecta el estado de ionización de los solutos y su polaridad.
Para retener los componentes orgánicos en las mezclas, las fases estacionarias, empaquetadas dentro de columnas, consisten en sustratos hidrofóbicos, unidos a la superficie de partículas porosas de gel de sílice en varias geometrías (esféricas, irregulares), con diferentes diámetros (sub-2 , 3, 5, 7, 10 um), con diferentes diámetros de poro (60, 100, 150, 300, A). La superficie de la partícula está cubierta por hidrocarburos unidos químicamente , como C3, C4, C8, C18 y más. Cuanto más tiempo dure el hidrocarburo asociado con la fase estacionaria, más tiempo se retendrán los componentes de la muestra. Algunas fases estacionarias también están hechas de partículas poliméricas hidrófobas, o partículas hibridadas de sílice y grupos orgánicos, para métodos en los que se utilizan fases móviles a pH extremo. La mayoría de los métodos actuales de separación de materiales biomédicos utilizan columnas C-18, a veces denominadas con nombres comerciales, como ODS (octadecilsilano) o RP-18.
Las fases móviles son mezclas de agua y disolventes orgánicos polares, la gran mayoría de los cuales son metanol y acetonitrilo . Estas mezclas suelen contener diversos aditivos como tampones ( acetato , fosfato , citrato ), tensioactivos (alquilaminas o alquilsulfonatos ) y aditivos especiales ( EDTA ). El objetivo del uso de suplementos de un tipo u otro es aumentar la eficiencia, la selectividad y controlar la retención de solutos.
Fases estacionarias
La historia y evolución de las fases estacionarias de fase invertida se describen en detalle en un artículo de Majors, Dolan, Carr y Snyder. [6]
En la década de 1970, la mayoría de las cromatografías líquidas se realizaban utilizando partículas sólidas como fases estacionarias, hechas de gel de sílice o alúmina sin modificar . Este tipo de técnica ahora se conoce como cromatografía en fase normal . Dado que la fase estacionaria es hidrófila en esta técnica y la fase móvil es no polar (que consta de disolventes orgánicos como hexano y heptano), las biomoléculas con propiedades hidrófilas en la muestra se adsorben fuertemente a la fase estacionaria. Además, no se disolvieron fácilmente en los disolventes de la fase móvil. Al mismo tiempo, las moléculas hidrofóbicas experimentan menos afinidad por la fase estacionaria polar y eluyen a través de ella temprano sin suficiente retención. Éstas fueron las razones por las que durante la década de 1970 las partículas a base de sílice fueron tratadas con hidrocarburos, inmovilizadas o unidas en su superficie, y las fases móviles fueron cambiadas a de naturaleza acuosa y polar, para acomodar sustancias biomédicas.
El uso de una fase estacionaria hidrófoba y fases móviles polares es esencialmente lo contrario de la cromatografía de fase normal, ya que la polaridad de las fases móvil y estacionaria se ha invertido, de ahí el término cromatografía de fase reversa. [7] [8] Como resultado, las moléculas hidrofóbicas en la fase móvil polar tienden a adsorberse en la fase estacionaria hidrofóbica, y las moléculas hidrofílicas en la muestra pasan a través de la columna y se eluyen primero. [7] [9] Las moléculas hidrófobas se pueden eluir de la columna disminuyendo la polaridad de la fase móvil utilizando un disolvente orgánico (no polar), lo que reduce las interacciones hidrófobas. Cuanto más hidrófoba sea la molécula, más fuertemente se unirá a la fase estacionaria y mayor será la concentración de disolvente orgánico necesaria para eluir la molécula.
Muchos de los parámetros matemáticos de la teoría de la cromatografía y consideraciones experimentales utilizadas en otros métodos cromatográficos también se aplican a RP-LC (por ejemplo, el factor de selectividad, resolución cromatográfica, recuento de placas, etc. Puede usarse para la separación de una Se utiliza normalmente para la separación de proteínas, [10] porque los disolventes orgánicos utilizados en la cromatografía de fase normal pueden desnaturalizar muchas proteínas.
Hoy en día, la RP-LC es una técnica analítica de uso frecuente. Hay una gran variedad de fases estacionarias disponibles para usar en RP-LC, lo que permite una gran flexibilidad en el desarrollo de los métodos de separación. [11] [12]
Fases estacionarias a base de sílice.
Las partículas de gel de sílice se utilizan comúnmente como fase estacionaria en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) por varias razones, [13] [14] que incluyen:
Área de superficie alta : las partículas de gel de sílice tienen una superficie alta, lo que permite interacciones directas con solutos o después de la unión de una variedad de ligandos para interacciones versátiles con las moléculas de la muestra, lo que conduce a mejores separaciones.
Estabilidad e inercia química y térmica : [15] El gel de sílice es químicamente estable, ya que normalmente no reacciona ni con los disolventes de la fase móvil ni con los compuestos que se separan, lo que da como resultado análisis precisos, repetibles y fiables.
Amplia aplicabilidad : [16] El gel de sílice es versátil y puede modificarse con varios grupos funcionales, lo que lo hace adecuado para una amplia gama de analitos y aplicaciones.
Separación eficiente : Las propiedades únicas de las partículas de gel de sílice, combinadas con su alta área superficial y el tamaño de poro del diámetro promedio controlado de las partículas, [17] facilitan la separación eficiente y precisa de compuestos en HPLC.
Reproducibilidad : las partículas de gel de sílice pueden ofrecer una alta reproducibilidad entre lotes, lo cual es crucial para análisis HPLC consistentes y confiables durante décadas.
Control del diámetro de las partículas y del tamaño de los poros : [18] [19] El gel de sílice se puede diseñar para que tenga tamaños de poros específicos, lo que permite un control preciso de la separación según el tamaño molecular.
Rentabilidad : la sílice es el elemento más abundante en la Tierra, por lo que su gel es una opción rentable para aplicaciones de HPLC, lo que lo adopta ampliamente en los laboratorios.
La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) ha clasificado las columnas de HPLC por tipos L#. [20] La columna más popular en esta clasificación es una sílice unida a una cadena de carbono octadecilo (C18) (clasificación USP L1). [21] A esto le siguen la sílice unida a C8 (L7), la sílice pura (L3), la sílice unida a ciano (CN) (L10) y la sílice unida a fenilo (L11). Tenga en cuenta que C18, C8 y fenilo son fases estacionarias dedicadas de fase inversa, mientras que las columnas CN se pueden utilizar en modo de fase inversa dependiendo de las condiciones del analito y de la fase móvil. No todas las columnas C18 tienen propiedades de retención idénticas. La funcionalización de la superficie de la sílice se puede realizar en una reacción monomérica o polimérica con diferentes organosilanos de cadena corta utilizados en un segundo paso para cubrir los grupos silanol restantes ( end-capping ). Si bien el mecanismo de retención general sigue siendo el mismo, diferencias sutiles en la química de la superficie de diferentes fases estacionarias conducirán a cambios en la selectividad.
Las columnas modernas tienen diferente polaridad según el ligando unido a la fase estacionaria. PFP es pentafluorfenilo. CN es ciano. NH2 es amino. ODS es octadecilo o C18. ODCN es una columna de modo mixto que consta de C18 y nitrilo. [22]
Los desarrollos recientes en soportes cromatográficos e instrumentación para cromatografía líquida (LC) facilitan separaciones rápidas y altamente eficientes, utilizando varias geometrías de fases estacionarias. [23] Se han propuesto varias estrategias analíticas, como el uso de soportes monolíticos a base de sílice , temperaturas elevadas de la fase móvil y columnas empaquetadas con partículas superficialmente porosas de menos de 3 μm (núcleo sólido o fusionado) [24] o con sub- Partículas totalmente porosas de 2 μm para uso en sistemas LC de presión ultraalta (UHPLC). [25]
Fases móviles
Boyes y Dong publicaron un artículo completo sobre las tendencias modernas y las mejores prácticas de selección de fase móvil en cromatografía de fase inversa. [26] Una fase móvil en la cromatografía de fase reversa consiste en mezclas de agua o tampones acuosos, a los que se agregan solventes orgánicos, para eluir analitos de una columna de fase reversa de manera selectiva. [7] [27] Los disolventes orgánicos añadidos deben ser miscibles con agua, y los dos disolventes orgánicos más comunes utilizados son el acetonitrilo y el metanol . También se pueden utilizar otros disolventes como etanol o 2-propanol ( alcohol isopropílico ) y tetrahidrofurano (THF). El disolvente orgánico también se denomina modificador, ya que se añade a la solución acuosa en la fase móvil para modificar la polaridad de la fase móvil. El agua es el disolvente más polar en la fase móvil de fase reversa; por lo tanto, reducir la polaridad de la fase móvil añadiendo modificadores mejora su fuerza de elución. Los dos modificadores orgánicos más utilizados son el acetonitrilo y el metanol, aunque el acetonitrilo es la opción más popular. También se puede utilizar isopropanol (2-propanol), debido a sus fuertes propiedades de elución, pero su uso está limitado por su alta viscosidad, lo que da como resultado contrapresiones más altas. Tanto el acetonitrilo como el metanol son menos viscosos que el isopropanol, aunque una mezcla de 50:50 por ciento de metanol:agua también es muy viscosa y provoca altas contrapresiones.
Los tres disolventes son esencialmente transparentes a los rayos UV. Esta es una propiedad crucial para la cromatografía de fase reversa común, ya que los componentes de la muestra generalmente se detectan mediante detectores UV. El acetonitrilo es más transparente que los demás en el rango de longitudes de onda UV bajas, por lo que se utiliza casi exclusivamente para separar moléculas con cromóforos débiles o nulos (grupos absorbentes de UV-VIS), como los péptidos. La mayoría de los péptidos sólo absorben en longitudes de onda bajas en el espectro ultravioleta (normalmente menos de 225 nm) y el acetonitrilo proporciona una absorbancia de fondo mucho menor en longitudes de onda bajas que otros disolventes comunes.
El pH de la fase móvil puede tener un papel importante en la retención de un analito y puede cambiar la selectividad de ciertos analitos. [28] [29] Para muestras que contienen solutos con grupos funcionales ionizados, como aminas , carboxilos , fosfatos , fosfonatos , sulfatos y sulfonatos , la ionización de estos grupos se puede controlar utilizando tampones de fase móvil. [30]
Por ejemplo, los grupos carboxílicos en los solutos se vuelven cada vez más cargados negativamente a medida que el pH de la fase móvil aumenta por encima de su pKa, por lo que toda la molécula se vuelve más polar y menos retenida en la fase estacionaria apolar. En este caso, elevar el pH de la fase móvil por encima de 4-5 = pH (que es el rango de pKa típico para los grupos carboxílicos) aumenta su ionización y, por lo tanto, disminuye su retención. Por el contrario, utilizar una fase móvil a un pH inferior a 4 [31] aumentará su retención, porque disminuirá su grado de ionización, volviéndolos menos polares.
Las mismas consideraciones se aplican a sustancias que contienen grupos funcionales básicos, como las aminas, cuyos rangos de pKa están alrededor de 8 y más, se retienen más a medida que aumenta el pH de la fase móvil, acercándose a 8 y más, porque están menos ionizadas y, por lo tanto, menos. polar. Sin embargo, en el caso de fases móviles de alto pH, la mayoría de las columnas tradicionales de fase reversa basadas en gel de sílice generalmente están limitadas para su uso con fases móviles a pH 8 y superiores, por lo tanto, el control sobre la retención de aminas en este rango es limitado. [32]
La elección del tipo de tampón es un factor importante en el desarrollo del método RP-LC, ya que puede afectar la retención, selectividad y resolución de los analitos de interés. [26] Al seleccionar un tampón para RP-HPLC, hay una serie de factores a considerar, que incluyen:
El pH deseado de la fase móvil : los tampones son más eficaces alrededor de su valor de pKa, por lo que es importante elegir un tampón con un pKa que esté cerca del pH deseado de la fase móvil.
La solubilidad del tampón en el disolvente orgánico : el tampón debe ser compatible con el disolvente orgánico que se utiliza en la fase móvil, principalmente con los disolventes orgánicos comunes mencionados anteriormente, acetonitrilo, metanol e isopropanol.
El límite de UV del tampón : en caso de detección de UV, el tampón debe tener una absorción de UV que esté por debajo de la longitud de onda de detección de los analitos de interés. Esto evitará que el tampón interfiera con la detección de esos analitos.
La compatibilidad del tampón con el detector : si se utiliza espectrometría de masas (MS) para la detección, el tampón debe ser compatible con el instrumento de espectrometría de masas (MS). [33] Algunos tampones, como los que contienen sales de fosfato, no se pueden utilizar con los detectores de MS, ya que no son volátiles según sea necesario e interfieren con la detección de MS al suprimir la ionización de los analitos, lo que los hace no detectados por MS.
Algunos de los tampones más comunes utilizados en RP-HPLC incluyen: [34]
Tampones de fosfato : el tampón de fosfato es versátil y se puede utilizar para lograr una amplia gama de valores de pH, gracias a sus valores de 3 pKa. También tienen un fondo UV muy bajo para la detección de rayos UV. Sin embargo, no son apropiados para la detección de EM.
Tampones de acetato : los tampones de acetato también son versátiles y se pueden utilizar para alcanzar un rango de valores de pH que normalmente se utilizan en RP-LC. En términos de detección de UV en longitudes de onda inferiores a 220 nm, no es tan favorable. El tampón de acetato de amonio es compatible con MS.
Tampones de formiato : los tampones de formiato son similares al tampón de acetato en términos del rango de pH utilizados y la detección UV limitada por debajo de 225 nm. Su acetato de amonio también es compatible con la EM.
Tampones de amonio : los tampones de amonio son volátiles y se utilizan a menudo en métodos LC-MS. También están limitados para la detección de rayos UV bajos.
Los analitos cargados se pueden separar en una columna de fase reversa mediante el uso de par iónico (también llamado interacción iónica). Esta técnica se conoce como cromatografía de apareamiento iónico de fase reversa. [35]
La elución se puede realizar de forma isocrática (la composición de agua y disolvente no cambia durante el proceso de separación) o mediante el uso de un gradiente de solución (la composición de agua y disolvente cambia durante el proceso de separación, normalmente al disminuir la polaridad).
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enlaces externos
Tablas que resumen diferentes tipos de fases inversas e información sobre el proceso de funcionalización.