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Dihidrofolato reductasa

La dihidrofolato reductasa , o DHFR , es una enzima que reduce el ácido dihidrofólico a ácido tetrahidrofólico , utilizando NADPH como donante de electrones , que puede convertirse en los tipos de cofactores de tetrahidrofolato utilizados en la química de transferencia de un carbono. En los seres humanos, la enzima DHFR está codificada por el gen DHFR . [5] [6] Se encuentra en la región q14.1 del cromosoma 5. [7]

Existen dos clases estructurales de DHFR, que no están relacionadas evolutivamente entre sí. La primera suele llamarse simplemente DHFR y se encuentra en cromosomas bacterianos y animales. Sin embargo, en las bacterias, la presión antibiótica ha hecho que esta clase desarrolle diferentes patrones de unión de moléculas diaminoheterocíclicas, lo que ha dado lugar a muchos "tipos" denominados bajo esta clase, mientras que los de los mamíferos siguen siendo muy similares. [8] La última (tipo II), representada por la R67 codificada por plástidos, es una enzima diminuta que funciona formando un homotetrámero. [9]

Función

La dihidrofolato reductasa convierte el dihidrofolato en tetrahidrofolato , un transportador de protones necesario para la síntesis de novo de purinas , ácido timidílico y ciertos aminoácidos . Si bien el gen funcional de la dihidrofolato reductasa se ha mapeado en el cromosoma 5, se han identificado múltiples pseudogenes procesados ​​sin intrones o genes similares a la dihidrofolato reductasa en cromosomas separados. [10]

Presente en todos los organismos, la DHFR tiene un papel fundamental en la regulación de la cantidad de tetrahidrofolato en la célula. El tetrahidrofolato y sus derivados son esenciales para la síntesis de purina y timidilato , que son importantes para la proliferación y el crecimiento celular. [11] La DHFR desempeña un papel central en la síntesis de precursores de ácidos nucleicos , y se ha demostrado que las células mutantes que carecen por completo de DHFR requieren glicina, una purina y timidina para crecer. [12] También se ha demostrado que la DHFR es una enzima implicada en la recuperación de tetrahidrobiopterina a partir de dihidrobiopterina. [13]


Estructura

Una lámina beta plegada central de ocho hebras constituye la característica principal del plegamiento de la cadena principal del polipéptido DHFR. [14] Siete de estas hebras son paralelas y la octava corre antiparalela. Cuatro hélices alfa conectan hebras beta sucesivas. [15] Los residuos 9-24 se denominan "Met20" o "bucle 1" y, junto con otros bucles, son parte del subdominio principal que rodea el sitio activo . [16] El sitio activo está situado en la mitad N-terminal de la secuencia, que incluye un dipéptido Pro - Trp conservado ; se ha demostrado que el triptófano está involucrado en la unión del sustrato por la enzima. [15]

Mecanismo

Mecanismo general

La reducción de dihidrofolato a tetrahidrofolato catalizada por DHFR

La DHFR cataliza la transferencia de un hidruro de NADPH a dihidrofolato con una protonación acompañante para producir tetrahidrofolato . [11] Al final, el dihidrofolato se reduce a tetrahidrofolato y el NADPH se oxida a NADP+ . La alta flexibilidad de Met20 y otros bucles cerca del sitio activo desempeñan un papel en la promoción de la liberación del producto, tetrahidrofolato. En particular, el bucle Met20 ayuda a estabilizar el anillo de nicotinamida del NADPH para promover la transferencia del hidruro de NADPH a dihidrofolato. [16]

El mecanismo de esta enzima es aleatorio, escalonado y en estado estable. En concreto, la reacción catalítica comienza con la unión del NADPH y el sustrato al sitio de unión de la enzima, seguida de la protonación y la transferencia del hidruro desde el cofactor NADPH al sustrato. Sin embargo, los dos últimos pasos no tienen lugar simultáneamente en un mismo estado de transición. [17] [18] En un estudio en el que se utilizaron métodos computacionales y experimentales, Liu et al . concluyen que el paso de protonación precede a la transferencia del hidruro. [19]

DHFR (bucle Met20 resaltado) + NADPH + folato

Se ha demostrado que el mecanismo enzimático de DHFR depende del pH, en particular el paso de transferencia de hidruro, ya que se ha demostrado que los cambios de pH tienen una influencia notable en la electrostática del sitio activo y el estado de ionización de sus residuos. [19] La acidez del nitrógeno objetivo en el sustrato es importante en la unión del sustrato al sitio de unión de la enzima, que se ha demostrado que es hidrófobo a pesar de que tiene contacto directo con el agua. [17] [20] Asp27 es el único residuo hidrófilo cargado en el sitio de unión, y la neutralización de la carga en Asp27 puede alterar el pKa de la enzima. Asp27 desempeña un papel fundamental en el mecanismo catalítico al ayudar a la protonación del sustrato y restringir el sustrato en la conformación favorable para la transferencia de hidruro. [21] [17] [20] Se ha demostrado que el paso de protonación está asociado con la tautomerización de enol, aunque esta conversión no se considera favorable para la donación de protones. [18] Se ha demostrado que una molécula de agua está involucrada en el paso de protonación. [22] [23] [24] La entrada de la molécula de agua al sitio activo de la enzima se ve facilitada por el bucle Met20. [25]

Cambios conformacionales de DHFR

En el esquema catalítico, la estructura cerrada se representa en rojo y la estructura ocluida en verde. En la estructura, el DHF y el THF están coloreados en rojo, el NADPH está coloreado en amarillo y el residuo de Met20 está coloreado en azul.

El ciclo catalítico de la reacción catalizada por DHFR incorpora cinco intermediarios importantes: holoenzima (E:NADPH), complejo de Michaelis (E:NADPH:DHF), complejo de producto ternario (E:NADP + :THF), complejo binario de tetrahidrofolato (E:THF) y complejo THF‚NADPH (E:NADPH:THF). El paso de disociación del producto (THF) de E:NADPH:THF a E:NADPH es el paso que determina la velocidad durante el recambio en estado estacionario. [21]

Los cambios conformacionales son críticos en el mecanismo catalítico de la DHFR. [26] El bucle Met20 de la DHFR puede abrir, cerrar u ocluir el sitio activo. [23] [17] En consecuencia, se asignan a Met20 tres conformaciones diferentes clasificadas como estados abierto, cerrado y ocluido. Además, se definió una conformación distorsionada adicional de Met20 debido a sus resultados de caracterización indistintos. [23] El bucle Met20 se observa en su conformación ocluida en los tres intermediarios de ligamiento del producto, donde el anillo de nicotinamida está ocluido del sitio activo. Esta característica conformacional explica el hecho de que la sustitución de NADP + por NADPH es anterior a la disociación del producto. Por lo tanto, la siguiente ronda de reacción puede ocurrir tras la unión del sustrato. [21]

R67 DHFR

Debido a su estructura única y sus características catalíticas, la DHFR R67 se ha estudiado ampliamente. La DHFR R67 es una DHFR codificada por plásmido R de tipo II sin relación genética o estructural con la DHFR cromosómica de E. coli. Es un homotetrámero que posee la simetría 222 con un solo poro del sitio activo que está expuesto al solvente. [27] Esta simetría del sitio activo da como resultado el modo de unión diferente de la enzima: puede unirse con dos moléculas de dihidrofolato (DHF) con cooperatividad positiva o dos moléculas de NADPH con cooperatividad negativa, o un sustrato más uno, pero solo el último tiene la actividad catalítica. [28] En comparación con la DHFR cromosómica de E. coli, tiene una K m más alta en la unión de dihidrofolato (DHF) y NADPH. La cinética catalítica mucho más baja muestra que la transferencia de hidruro es el paso que determina la velocidad en lugar de la liberación del producto (THF). [29]

En la estructura R67 DHFR, el homotetrámero forma un poro en el sitio activo. En el proceso catalítico, el DHF y el NADPH entran en el poro desde posiciones opuestas. La interacción de apilamiento π-π entre el anillo de nicotinamida del NADPH y el anillo de pteridina del DHF conectan firmemente dos reactivos en el sitio activo. Sin embargo, se observó la flexibilidad de la cola de p-aminobenzoilglutamato del DHF al unirse, lo que puede promover la formación del estado de transición . [30]

Importancia clínica

Las mutaciones de DHFR causan deficiencia de dihidrofolato reductasa , un error innato autosómico recesivo poco común del metabolismo del folato que provoca anemia megaloblástica , pancitopenia y deficiencia cerebral grave de folato . Estos problemas se pueden superar con la suplementación con una forma reducida de folato, generalmente ácido folínico . [10] [31] [32]

Aplicaciones terapéuticas

La DHFR es un objetivo farmacéutico atractivo para la inhibición debido a su papel fundamental en la síntesis del precursor del ADN ( timina ). El trimetoprima , un antibiótico , inhibe la DHFR bacteriana, mientras que el metotrexato , un agente quimioterapéutico , inhibe la DHFR de los mamíferos. Sin embargo, se ha desarrollado resistencia contra algunos fármacos, como resultado de cambios mutacionales en la propia DHFR. [33]

Cáncer

La DHFR es responsable de los niveles de tetrahidrofolato en una célula, y su inhibición puede limitar el crecimiento y la proliferación de células que son característicos del cáncer y de las infecciones bacterianas. El metotrexato , un inhibidor competitivo de la DHFR, es uno de esos fármacos anticancerígenos que inhibe la DHFR. [34]

El folato es necesario para el crecimiento, [35] y la vía del metabolismo del folato es un objetivo en el desarrollo de tratamientos para el cáncer. La DHFR es uno de esos objetivos. Se ha demostrado que un régimen de fluorouracilo , doxorrubicina y metotrexato prolonga la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico avanzado. [36] Estudios adicionales sobre inhibidores de la DHFR pueden conducir a más formas de tratar el cáncer.

Infección

Las bacterias también necesitan DHFR para crecer y multiplicarse y, por lo tanto, los inhibidores selectivos para DHFR bacteriano han encontrado aplicación como agentes antibacterianos. [37] Se ha demostrado que trimetoprima tiene actividad contra una variedad de patógenos bacterianos Gram-positivos . [37] Sin embargo, la resistencia a trimetoprima y otros medicamentos dirigidos a DHFR puede surgir debido a una variedad de mecanismos, lo que limita el éxito de sus usos terapéuticos. [38] [39] [40] La resistencia puede surgir de la amplificación del gen DHFR, mutaciones en DHFR, [41] [42] disminución en la absorción de los medicamentos, entre otros. Independientemente, trimetoprima y sulfametoxazol en combinación se han utilizado como agente antibacteriano durante décadas. [37]

La pirimetamina es un agente antiprotozoario ampliamente utilizado. [43]

Otras clases de compuestos que atacan a la DHFR en general, y a las DHFR bacterianas en particular, pertenecen a clases como diaminopteridinas, diaminotriazinas, diaminopirroloquinazolinas, estilbenos, chalconas, desoxibenzoínas, diaminoquinazolinas, diaminopirroloquinazolinas, por nombrar solo algunas.

Tratamiento potencial del ántrax

Alineación estructural de la dihidrofolato reductasa cromosómica (tipo I) de Bacillus anthracis (BaDHFR), Staphylococcus aureus (SaDHFR), Escherichia coli (EcDHFR) y Streptococcus pneumoniae (SpDHFR)

La dihidrofolato reductasa de Bacillus anthracis (BaDHFR) es un fármaco diana validado en el tratamiento de la enfermedad infecciosa ántrax. La BaDHFR es menos sensible a los análogos de la trimetoprima que la dihidrofolato reductasa de otras especies como Escherichia coli , Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae . Una alineación estructural de la dihidrofolato reductasa de las cuatro especies muestra que solo la BaDHFR tiene la combinación de fenilalanina y tirosina en las posiciones 96 y 102, respectivamente.

La resistencia de BaDHFR a los análogos de trimetoprima se debe a estos dos residuos (F96 e Y102), que también confieren una cinética y una eficiencia catalítica mejoradas. [44] La investigación actual utiliza mutantes del sitio activo en BaDHFR para guiar la optimización de los nuevos inhibidores antifolato. [44]

Como herramienta de investigación

La DHFR se ha utilizado como herramienta para detectar interacciones proteína-proteína en un ensayo de complementación de fragmentos de proteína (PCA), utilizando un enfoque de proteína dividida. [45]

Las células CHO que carecen de DHFR son la línea celular más utilizada para la producción de proteínas recombinantes. Estas células se transfectan con un plásmido que lleva el gen dhfr y el gen de la proteína recombinante en un único sistema de expresión y, a continuación, se someten a condiciones selectivas en un medio carente de timidina . Sólo sobreviven las células con el gen DHFR exógeno junto con el gen de interés. La suplementación de este medio con metotrexato, un inhibidor competitivo de DHFR, puede seleccionar además aquellas células que expresan los niveles más altos de DHFR y, por tanto, seleccionar a los principales productores de proteínas recombinantes. [46]

Interacciones

Se ha demostrado que la dihidrofolato reductasa interactúa con GroEL [47] y Mdm2 . [48]

Mapa interactivo de rutas

Haga clic en los genes, proteínas y metabolitos que aparecen a continuación para acceder a los artículos correspondientes. [§ 1]

  1. ^ El mapa de la ruta interactiva se puede editar en WikiPathways: "FluoropyrimidineActivity_WP1601".

Referencias

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