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Ensayo de complementación de fragmentos de proteínas

En el campo de la biología molecular , un ensayo de complementación de fragmentos de proteína , o PCA, es un método para la identificación y cuantificación de interacciones proteína-proteína . En el PCA, las proteínas de interés ("cebo" y "presa") están cada una unidas covalentemente a fragmentos de una tercera proteína (por ejemplo, DHFR, que actúa como un "reportero"). La interacción entre las proteínas cebo y presa acerca los fragmentos de la proteína reportera para permitirles formar una proteína reportera funcional cuya actividad se puede medir. Este principio se puede aplicar a muchas proteínas reporteras diferentes y también es la base del sistema de dos híbridos de levadura , un ensayo PCA arquetípico.

Ensayos de proteínas divididas

Principio general del ensayo de complementación de proteínas: una proteína se divide en dos mitades (N- y C-terminal) y se reconstituye mediante dos proteínas interactuantes que se fusionan a las mitades N y C (aquí llamadas "cebo" y "presa" porque una proteína cebo puede usarse para encontrar una proteína presa interactuante). La actividad de la proteína reconstituida debe ser fácilmente detectable, por ejemplo, como en el caso de la proteína fluorescente verde (GFP).

Cualquier proteína que pueda dividirse en dos partes y reconstituirse de forma no covalente para formar una proteína funcional puede utilizarse en un PCA. Sin embargo, los dos fragmentos tienen una afinidad baja entre sí y deben unirse mediante otras proteínas interactuantes fusionadas a ellos (a menudo llamadas "cebo" y "presa", ya que la proteína cebo puede utilizarse para identificar una proteína presa, consulte la figura ). La proteína que produce una lectura detectable se denomina "reportero". Por lo general, se utilizan como reporteros enzimas que confieren resistencia a la privación de nutrientes o antibióticos, como la dihidrofolato reductasa o la beta-lactamasa respectivamente, o proteínas que dan señales colorimétricas o fluorescentes. Cuando se reconstituyen proteínas fluorescentes, el PCA se denomina ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular . Las siguientes proteínas se han utilizado en PCA de proteína dividida:

Aplicaciones en todo el genoma

Los métodos mencionados anteriormente se han aplicado a genomas completos , por ejemplo, levadura [3] o bacterias de la sífilis . [19]

Referencias

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