Ensayo de complementación de fragmentos de proteínas
En el campo de la biología molecular , un ensayo de complementación de fragmentos de proteína , o PCA, es un método para la identificación y cuantificación de interacciones proteína-proteína . En el PCA, las proteínas de interés ("cebo" y "presa") están cada una unidas covalentemente a fragmentos de una tercera proteína (por ejemplo, DHFR, que actúa como un "reportero"). La interacción entre las proteínas cebo y presa acerca los fragmentos de la proteína reportera para permitirles formar una proteína reportera funcional cuya actividad se puede medir. Este principio se puede aplicar a muchas proteínas reporteras diferentes y también es la base del sistema de dos híbridos de levadura , un ensayo PCA arquetípico.
Ensayos de proteínas divididas
Cualquier proteína que pueda dividirse en dos partes y reconstituirse de forma no covalente para formar una proteína funcional puede utilizarse en un PCA. Sin embargo, los dos fragmentos tienen una afinidad baja entre sí y deben unirse mediante otras proteínas interactuantes fusionadas a ellos (a menudo llamadas "cebo" y "presa", ya que la proteína cebo puede utilizarse para identificar una proteína presa, consulte la figura ). La proteína que produce una lectura detectable se denomina "reportero". Por lo general, se utilizan como reporteros enzimas que confieren resistencia a la privación de nutrientes o antibióticos, como la dihidrofolato reductasa o la beta-lactamasa respectivamente, o proteínas que dan señales colorimétricas o fluorescentes. Cuando se reconstituyen proteínas fluorescentes, el PCA se denomina ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular . Las siguientes proteínas se han utilizado en PCA de proteína dividida:
Luciferasa , [11] [12] incluyendo ReBiL (luciferasa bimolecular mejorada por recombinasa) [13] y luciferasa de Gaussia princeps . [14] Los productos comerciales que utilizan luciferasa incluyen NanoLuc y NanoBIT. [15] También se ha desarrollado una modificación para interacciones asociadas a gotitas de lípidos. [16]
Los métodos mencionados anteriormente se han aplicado a genomas completos , por ejemplo, levadura [3] o bacterias de la sífilis . [19]
Referencias
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Lectura adicional
Rochette S, Diss G, Filteau M, Leducq JB, Dubé AK, Landry CR (marzo de 2015). "Cribado de la interacción proteína-proteína en todo el genoma mediante el ensayo de complementación de fragmentos de proteína (PCA) en células vivas". Journal of Visualized Experiments (97). doi :10.3791/52255. PMC 4401175. PMID 25867901 .