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Microscopía electrónica criogénica.

Titán Krios en la Universidad de Leeds

La microscopía electrónica criogénica ( crioEM ) es una técnica de criomicroscopía que se aplica a muestras enfriadas a temperaturas criogénicas . En el caso de los especímenes biológicos, la estructura se conserva incrustándola en un entorno de hielo vítreo . Se aplica una solución de muestra acuosa a una rejilla y se congela por inmersión en etano líquido o una mezcla de etano líquido y propano . [1] Si bien el desarrollo de la técnica comenzó en la década de 1970, los avances recientes en la tecnología de detectores y los algoritmos de software han permitido la determinación de estructuras biomoleculares con una resolución casi atómica. [2] Esto ha atraído una gran atención al enfoque como una alternativa a la cristalografía de rayos X o la espectroscopia de RMN para la determinación de la estructura macromolecular sin la necesidad de cristalización. [3]

En 2017, el Premio Nobel de Química fue otorgado a Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson "por desarrollar la microscopía crioelectrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en solución". [4] Nature Methods también nombró a cryoEM como el "Método del año" en 2015. [5]

Historia

Desarrollo temprano

En la década de 1960, el uso de la microscopía electrónica de transmisión para métodos de determinación de estructuras estaba limitado debido al daño por radiación causado por los haces de electrones de alta energía. Los científicos plantearon la hipótesis de que examinar especímenes a bajas temperaturas reduciría el daño por radiación inducido por el haz. [6] Tanto el helio líquido (-269  °C o 4  K o -452,2  °F ) como el nitrógeno líquido (-195,79 °C o 77 K o -320 °F) se consideraron criógenos. En 1980, Erwin Knapek y Jacques Dubochet publicaron comentarios sobre el daño del haz a temperaturas criogénicas compartiendo observaciones que:

Se descubrió que los cristales finos montados sobre una película de carbono eran entre 30 y 300 veces más resistentes a los rayos a 4 K que a temperatura ambiente... La mayoría de nuestros resultados pueden explicarse suponiendo que la crioprotección en la región de 4 K depende en gran medida de la temperatura. [7]

Sin embargo, estos resultados no fueron reproducibles y solo dos años después se publicaron enmiendas en Nature informando que la resistencia del haz era menos significativa de lo previsto inicialmente. La protección obtenida a 4 K fue más cercana a "diez veces para muestras estándar de L- valina ", [8] de lo que se había indicado anteriormente.

En 1981, Alasdair McDowall y Jacques Dubochet, científicos del Laboratorio Europeo de Biología Molecular , informaron sobre la primera implementación exitosa de crioEM. [9] McDowall y Dubochet vitrificaron agua pura en una película delgada rociándola sobre una película de carbón hidrófilo que se sumergió rápidamente en criógeno ( propano líquido o etano líquido enfriado a 77 K). La fina capa de hielo amorfo tenía menos de 1 µm de espesor y un patrón de difracción de electrones confirmó la presencia de hielo amorfo/vítreo. En 1984, el grupo de Dubochet demostró el poder de la crioEM en biología estructural con el análisis de adenovirus vitrificado tipo 2, bacteriófago T4 , virus del bosque Semliki , bacteriófago CbK y virus de la estomatitis vesicular . [10]

Avances recientes

La década de 2010 estuvo marcada por avances drásticos en las cámaras electrónicas. En particular, las mejoras realizadas en los detectores de electrones directos han llevado a una "revolución de la resolución" [11] empujando la barrera de resolución por debajo del límite crucial de ~2-3 Å para resolver la posición y orientación de los aminoácidos. [12]

Henderson ( Laboratorio de Biología Molecular MRC , Cambridge, Reino Unido) formó un consorcio con ingenieros del Laboratorio Rutherford Appleton y científicos de la Sociedad Max Planck para financiar y desarrollar un primer prototipo. A continuación, el consorcio unió fuerzas con el fabricante de microscopios electrónicos FEI para desarrollar y comercializar el nuevo diseño. Casi al mismo tiempo, Gatan Inc. de Pleasanton, California, presentó un detector similar diseñado por Peter Denes ( Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley ) y David Agard ( Universidad de California, San Francisco ). Un tercer tipo de cámara fue desarrollado por Nguyen-Huu Xuong en la empresa Direct Electron ( San Diego, California ). [11]

Más recientemente, los avances en el uso de estructuras de imágenes basadas en proteínas están ayudando a resolver los problemas del sesgo de orientación de la muestra y el límite de tamaño. Las proteínas de menos de ~50 kDa generalmente tienen una SNR insuficiente para poder resolver las partículas de proteínas en la imagen, lo que dificulta o imposibilita la reconstrucción 3D. [13] Los andamios de imágenes aumentan la SNR de proteínas más pequeñas al unirlas a un objeto más grande, el andamio. El grupo de Yeates en UCLA pudo crear una imagen más clara de tres variantes de KRAS (de aproximadamente 19 kDa de tamaño) utilizando un andamio de imágenes rígido y usando DARPins como dominio de unión modular entre el andamio y la proteína de interés. [14]

Premio Nobel de Química 2017

En reconocimiento al impacto que la crioEM ha tenido en la bioquímica, tres científicos, Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson , recibieron el Premio Nobel de Química "por desarrollar la microscopía crioelectrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en solución". [4]

Comparaciones con la cristalografía de rayos X

Tradicionalmente, la cristalografía de rayos X ha sido la técnica más popular para determinar las estructuras tridimensionales de moléculas biológicas. [15] Sin embargo, las mejoras antes mencionadas en crioEM han aumentado su popularidad como herramienta para examinar los detalles de las moléculas biológicas. Desde 2010, los depósitos anuales de estructuras crioEM han superado a la cristalografía de rayos X. [16] Aunque la cristalografía de rayos X tiene un número drásticamente mayor de depósitos totales debido a una historia de décadas más larga, se proyecta que los depósitos totales de los dos métodos se eclipsarán alrededor de 2035. [16]

La resolución de la cristalografía de rayos X está limitada por la homogeneidad del cristal, [17] y lograr que moléculas biológicas con condiciones de cristalización ideales desconocidas alcancen un estado cristalino puede llevar mucho tiempo y, en casos extremos, meses o incluso años. [18] Por el contrario, la preparación de muestras en crioEM puede requerir varias rondas de detección y optimización para superar problemas como la agregación de proteínas y las orientaciones preferidas, [19] [20] pero no requiere que la muestra forme un cristal, sino muestras para Los crioEM se congelan instantáneamente y se examinan en sus estados casi nativos. [21]

According to Proteopedia, the median resolution achieved by X-ray crystallography (as of May 19, 2019) on the Protein Data Bank is 2.05 Å,[17] and the highest resolution achieved on record (as of September 30, 2022) is 0.48 Å.[22] As of 2020, the majority of the protein structures determined by cryoEM are at a lower resolution of 3–4 Å.[23] However, as of 2020, the best cryoEM resolution has been recorded at 1.22 Å,[20] making it a competitor in resolution in some cases.

Correlative light CryoTEM and CryoET

In 2019, correlative light CryoTEM and CryoET were used to observe tunnelling nanotubes (TNTs) in neuronal cells.[24]

Scanning electron cryomicroscopy

Scanning electron cryomicroscopy (cryoSEM) is a scanning electron microscopy technique with a scanning electron microscope's cold stage in a cryogenic chamber.

Cryogenic transmission electron microscopy

Cryogenic transmission electron microscopy (cryoTEM) is a transmission electron microscopy technique that is used in structural biology and materials science. Colloquially, the term "cryogenic electron microscopy" or its shortening "cryoEM" refers to cryogenic transmission electron microscopy by default, as the vast majority of cryoEM is done in transmission electron microscopes, rather than scanning electron microscopes.

Centers

The Federal Institute of Technology, the University of Lausanne and the University of Geneva opened the Dubochet Center For Imaging (DCI) at the end of November 2021, for the purposes of applying and further developing cryoEM.[25] Less than a month after the first identification of the SARS-CoV-2 Omicron variant, researchers at the DCI were able to define its structure, identify the crucial mutations to circumvent individual vaccines and provide insights for new therapeutic approaches.[26]

The Danish National cryoEM Facility also known as EMBION was inaugurated on December 1, 2016. EMBION is a cryoEM consortium between Danish Universities (Aarhus University host and University of Copenhagen co-host).

Single particle analysis workflow

Advanced methods

Ver también

Referencias

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