Construcción de código de función-espaciador-lípido

Fig. 1. Analogía estructural de una minifigura de Lego con un modelo de relleno químico de un constructo FSL. El constructo FSL es un espaciador de oligoglicina parcialmente carboximetilada (CMG2) basado en péptidos con lípido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina ( DOPE ).

Los constructos de Kode de Función-Espaciador-Lípido (FSL) (Tecnología Kode) son constructos de ingeniería de biosuperficies anfifáticos , dispersables en agua, que se pueden utilizar para diseñar la superficie de células , virus y organismos, o para modificar soluciones y superficies no biológicas con bioactivos. ^{[1] [2] [3]} Los constructos de Kode de FSL se incorporan de forma espontánea y estable a las membranas celulares. Los constructos de Kode de FSL con todas estas características mencionadas anteriormente también se conocen como constructos de Kode. [ ^{1] El proceso de modificación de superficies con constructos de Kode de FSL se conoce como "codificación" y las} células "codificadas" resultantes ^[1] , los virus y los liposomas se conocen respectivamente como kodecitos [ 1 ^{] [4]} y kodeviriones ^{[1] [5]}

Descripción de la tecnología

Todas las superficies vivas están decoradas con una amplia gama de moléculas complejas, que son moduladores clave de las comunicaciones químicas y otras funciones como la protección, la adhesión , la infectividad , la apoptosis , etc. Las construcciones de Kode espaciador funcional-lípido (FSL) se pueden sintetizar para imitar los componentes bioactivos presentes en las superficies biológicas y luego volver a presentarlos de formas novedosas. ^{[1] [2]} La arquitectura de una construcción FSL Kode, como implícito en el nombre, consta de tres componentes: un grupo de cabeza funcional, un espaciador y una cola lipídica. ^[3] Esta estructura es análoga a una minifigura de Lego en el sentido de que tienen tres componentes estructurales, y cada componente tiene un propósito separado. ^{[1] [2]} En los ejemplos que se muestran en todas las figuras, se ha utilizado una " minifigura " de Lego para la analogía. Sin embargo, debe apreciarse que esto es simplemente una representación y que la verdadera similitud estructural varía significativamente entre las minifiguras de Lego y las construcciones FSL Kode (fig. 1) . El grupo funcional de un FSL es equivalente a la cabeza de una minifigura de Lego, ya que ambos están en la extremidad y llevan los componentes funcionales del personaje. El espaciador del FSL es equivalente al cuerpo de la minifigura de Lego y los brazos de la minifigura son representativos de las sustituciones que pueden diseñarse en la composición química del espaciador. El lípido del FSL lo ancla a las membranas lipídicas y le da al constructo FSL su naturaleza anfipática que puede hacer que se autoensamble. Debido a que la cola lipídica puede actuar directamente como un ancla, es análoga a las piernas de una minifigura de Lego.

Diseño flexible

El grupo funcional, el espaciador y los componentes de la cola lipídica del constructo FSL Kode pueden diseñarse individualmente, lo que da como resultado constructos FSL Kode con funciones biológicas específicas. ^[2] El grupo funcional de la cabeza suele ser el componente bioactivo del constructo y los diversos espaciadores y lípidos influyen y afectan su presentación, orientación y ubicación en una superficie. Un requisito fundamental para la definición de un constructo FSL Kode es que sea dispersable en agua y se incorpore de forma espontánea y estable a las membranas celulares. Otros bioconjugados lipídicos que incluyen componentes similares a los FSL pero que no tienen estas características no se denominan constructos de función-espaciador-lípido Kode. ^[2]

Grupos funcionales

Fuente: ^[3]

Fig. 2 Diagrama que muestra las características del constructo función-espaciador-lípido de un kodecito , utilizando la analogía de una minifigura de Lego. Como se indica en la figura, el grupo de funciones análogo a la cabeza de la minifigura se puede organizar en diferentes sustancias, el espaciador análogo al cuerpo de la minifigura (incluidos los brazos) puede tener una variedad de características diferentes y el lípido o las piernas de la minifigura pueden ser una variedad de lípidos diferentes. Juntos, los tres componentes de función, espaciador y lípido representan el constructo FSL. Kode Biotech Limited

Ya se han incorporado una amplia gama de grupos funcionales a las construcciones de FSL Kode. Entre ellos se incluyen:

• Carbohidratos : desde monosacáridos hasta polisacáridos , incluidos antígenos de grupos sanguíneos , ^{[1] [2] [6 ] [7] [8] [9] [10] [11] [12]} oligómeros de ácido hialurónico y residuos de ácido siálico ^[2]
• Péptido/proteína : desde aminoácidos individuales ^{[8] [13] [14] [15]} hasta proteínas tan grandes como anticuerpos ^[1]
• Etiquetas , incluidos fluoróforos , ^{[1] [2] [5 ] [9] [10 ] [16] [17]} radioisótopos , ^{[1] [5]} biotina , ^{[1] [2] [9] [10]} etc.
• Otros : fracciones químicas como maleimida , ^{[15] [18]} residuos clic , PEG , compuestos cargados

Nota 1: Multimérico: la presentación del residuo F puede ser como multímeros con espaciamiento controlado y ser variable.

Nota 2: Masa: la masa que se puede anclar mediante construcciones de FSL Kode puede variar de 200 a >1x10 ⁶ Da

Espaciadores

Fuente: ^[3]

El espaciador es una parte integral del constructo FSL Kode y le otorga varias características importantes, incluida la dispersabilidad en agua . ^[2]

• Longitud : el espaciador puede variar en longitud, por ejemplo, 1,9 nm (Ad), 7,2 nm (CMG2), 11,5 nm (CMG4), ^[2] lo que permite una mejor presentación de los grupos funcionales en la biosuperficie.
• Optimiza la presentación de 'F' : la presentación del bioactivo (grupo funcional) en un espaciador reduce el impedimento estérico y aumenta las superficies bioactivas expuestas y disponibles para interacciones.
• Rigidez : el espaciador se puede modificar para que sea flexible o rígido según las características deseadas.
• Sustituciones (representadas por las hojas en el tallo): el espaciador puede modificarse tanto en carga como en polaridad .
• Ramas : normalmente el espaciador es lineal, pero también puede ser ramificado, incluyendo un espaciamiento específico de las ramas para optimizar la presentación y la interacción del grupo F.
• Inerte : un aspecto importante para el diseño de los constructos FSL Kode es la naturaleza biológicamente inerte del espaciador. Esta característica significa que los componentes SL de los constructos no reaccionan con el suero sin diluir. En consecuencia, los constructos son compatibles con el uso in vivo y pueden mejorar la sensibilidad de los ensayos de diagnóstico al permitir el uso de suero sin diluir.

Lípidos

Fuente: ^[3]

La cola lipídica es esencial para permitir la inserción y retención de la membrana lipídica , pero también para otorgarle al constructo características anfifílicas que permiten el recubrimiento hidrofílico de la superficie (debido a la formación de capas bilipídicas ). Los diferentes lípidos de membrana que se pueden usar para crear FSL tienen diferentes características fisicoquímicas de membrana y, por lo tanto, pueden afectar la función biológica del FSL. Los lípidos en los constructos FSL Kode incluyen: ^[2]

• Diacilo/diaquilo, por ejemplo, DOPE
• Esteroles, por ejemplo, el colesterol.
• Ceramidas

Optimización de la presentación del grupo funcional (F)

Una de las funciones importantes de un constructo FSL es que puede optimizar la presentación de antígenos , tanto en superficies celulares como en membranas en fase sólida. Esta optimización se logra principalmente mediante el espaciador y, en segundo lugar, mediante la cola lipídica. En un inmunoensayo típico , el antígeno se deposita directamente sobre la superficie de la microplaca y se une a la superficie de forma aleatoria o en una orientación preferida según los residuos presentes en la superficie de este antígeno. Por lo general, este proceso de deposición no está controlado. Por el contrario, el constructo FSL Kode unido a una microplaca presenta el antígeno alejado de la superficie en una orientación con un alto nivel de exposición al medio ambiente. Además, los inmunoensayos típicos utilizan péptidos recombinantes en lugar de antígenos peptídicos discretos. Como el péptido recombinante es muchas veces más grande que el epítopo de interés, muchas secuencias de péptidos no deseadas y no deseadas también están representadas en la microplaca. Estas secuencias adicionales pueden incluir secuencias relacionadas con microbios no deseadas (según lo determinado por un análisis BLAST ) que pueden causar problemas de reactividad cruzada de bajo nivel. A menudo, el mecanismo por el cual un inmunoensayo es capaz de superar esta actividad de bajo nivel es diluir el suero de modo que no se observen los anticuerpos reactivos microbianos de bajo nivel , y solo los anticuerpos específicos de alto nivel den como resultado un resultado interpretable. Por el contrario, las construcciones FSL Kode suelen utilizar fragmentos de péptidos seleccionados específicamente (hasta 40 aminoácidos), ^{[15] [18]} superando así la reactividad cruzada con secuencias microbianas y permitiendo el uso de suero sin diluir (lo que aumenta la sensibilidad ).

El componente F se puede mejorar aún más presentándolo en formatos multiméricos y con espaciado específico. Los cuatro tipos de formato multimérico incluyen unidades repetitivas lineales, unidades repetitivas lineales con espaciado, grupos y ramificaciones (Fig. 4) .

Mecanismos de interacción

Construcción del código FSL anfifílico

El constructo FSL Kode, por la naturaleza de su composición al poseer regiones tanto hidrofóbicas como hidrofílicas, es anfifílico (o anfipático). Esta característica determina la forma en que el constructo interactuará con las superficies. Cuando están presentes en una solución, pueden formar micelas simples o adoptar estructuras de bicapa más complejas con dos ejemplos simplistas que se muestran en la Fig. 5a . Se esperan estructuras más complejas. La naturaleza real de las micelas FSL no se ha determinado. Sin embargo, con base en la función estructural normal de las micelas, se espera que esté determinada en parte por la combinación de grupo funcional, espaciador y lípido junto con temperatura, concentración , tamaño e hidrofobicidad/hidrofilicidad para cada tipo de constructo FSL Kode.

Los recubrimientos superficiales se producirán mediante dos mecanismos teóricos, el primero es la interacción hidrófoba directa de la cola lipídica con una superficie hidrófoba que da como resultado una monocapa de FSL en la superficie (Fig. 5b) . La unión hidrófoba de la FSL se producirá a través de su cola lipídica hidrófoba que interactúa directamente con la superficie hidrófoba ( lipófila ). El segundo recubrimiento superficial se producirá mediante la formación de bicapas, ya que la cola lipídica no puede reaccionar con la superficie hidrófila. En este caso, los lípidos inducirán la formación de una bicapa, cuya superficie será hidrófila. Esta membrana hidrófila interactuará entonces directamente con la superficie hidrófila y probablemente encapsulará fibras . Esta unión de bicapa hidrófila es el mecanismo esperado por el cual las FSL pueden unirse a membranas fibrosas como el papel ^[19] y las fibras de vidrio (Fig. 5c) y (Fig. 9) .

Modificación de la membrana lipídica

Después de etiquetar la superficie con los bioactivos F seleccionados, los constructos estarán presentes y orientados en la superficie de la membrana. Se espera que el FSL sea altamente móvil dentro de la membrana y la elección de la cola lipídica afectará su partición relativa dentro de la membrana. ^{[2] [7]} Se espera que el constructo, a menos que tenga un comportamiento flip-flop, permanezca presente en la superficie. Sin embargo, la modificación no es permanente en células vivas y los constructos se perderán (consumirán) a una tasa proporcional a la actividad en la membrana y la tasa de división de la célula (con las células muertas permaneciendo altamente etiquetadas). ^[1] Además, cuando están presentes in vivo con lípidos séricos, los FSL se eluirán de la membrana al plasma a una tasa de aproximadamente 1% por hora. ^{[5] [10]} En células fijas o células inactivas (por ejemplo, glóbulos rojos) almacenadas en medios libres de suero, los constructos se retienen normalmente. ^[1]

Los liposomas se codifican fácilmente simplemente añadiendo construcciones FSL Kode a la preparación. El contacto de los liposomas codificados con microplacas u otras superficies puede provocar el marcado de la superficie de la microplaca.

Interacción superficial no biológica

Los recubrimientos superficiales no biológicos se producen a través de dos mecanismos: el primero es la interacción hidrófoba directa de la cola lipídica con una superficie hidrófoba, lo que da como resultado una monocapa de FSL en la superficie. El segundo recubrimiento superficial se produce mediante la formación de bicapas, que probablemente encapsulen fibras o se produzcan a través del grupo F hidrófilo. Este es el mecanismo esperado por el que los FSL se unen a membranas fibrosas como el papel ^[19] y las fibras de vidrio. Un estudio reciente ha descubierto que, cuando se optimizan las construcciones de FSL Kode, se puede glicosilar en unos pocos segundos casi cualquier superficie no biológica, incluidos metales, vidrio, plásticos, cauchos y otros polímeros. ^[20]

Características tecnológicas

Las características tecnológicas de las construcciones FSL Kode y el proceso de codificación se pueden resumir de la siguiente manera:

• Rápido y sencillo : basta con un contacto durante 10 a 120 minutos para que las construcciones se incorporen de forma espontánea y estable, sin necesidad de lavarlas. ^[1]
• Replicable : las mismas variables (tiempo, temperatura, concentración) equivalen al mismo resultado. ^{[1] [6]}
• Toxicidad – Los constructos FSL son biocompatibles , se dispersan en soluciones biológicas sin solventes ni detergentes. Se etiquetan de forma no covalente y no son genéticos. La vitalidad y funcionalidad normales se mantienen en células/viriones/organismos modificados. ^{[7] [9] [10] [16]} Los experimentos de toxicidad/vitalidad en pequeños animales de laboratorio, pez cebra , cultivos celulares , espermatozoides y embriones no encuentran efectos tóxicos dentro de los rangos fisiológicos.
• Anfifílico : la naturaleza anfifílica del constructo FSL Kode los hace dispersables en agua (solución transparente de micelas), pero una vez que interactúan con una membrana, se insertan/recubren y se vuelven resistentes al agua.
• Diseño variable : una sola F se puede presentar de más de 100 formas variando el espaciador y el lípido.
• Alta biovisibilidad : como el espaciador mantiene la fracción F alejada de la membrana, es posible lograr una mayor sensibilidad, especificidad y reactividad que se puede optimizar mediante el uso de presentaciones de biomarcadores múltiples y variables en la misma superficie.
• Aditivo : la modificación con FSL es compatible con otras tecnologías, lo que permite a los usuarios agregar características adicionales a células, virus, organismos o superficies que ya han sido modificados con métodos más tradicionales. Se pueden agregar múltiples construcciones FSL a una superficie simultáneamente simplemente creando una mezcla de construcciones FSL Kode. Las construcciones se insertan en membranas de células vivas o fijas ( glutaraldehído ).

Fig. 8 Los FSL se pueden crear fácilmente a partir de péptidos que contienen cisteína , proteínas o cualquier otro tioles de interés biológico. La mezcla de un péptido que contiene cisteína con FSL-RFG (maleimida), en tampón 4MMF , permite que el péptido reaccione con el residuo de maleimida del FSL (a través de la conocida reacción de adición nucleofílica de Michael ). Después de la incubación durante la noche y el secado al vacío, se crea un péptido FSL. No se requiere purificación.

• Síntesis simple de péptidos FSL : existe un constructo FSL Kode con grupo funcional reactivo con maleimida como su grupo funcional que se puede utilizar para la preparación de FSL a partir de péptidos que contienen cisteína , proteínas o cualquier otro tiol de interés biológico. ^{[15] [18]} El enfoque sintético eficaz se basa en la conocida adición nucleofílica de Michael a las maleimidas (Fig. 7) .
• "Glicolípidos" sintéticos : una familia de construcciones FSL son glicolípidos sintéticos con colas hidrofóbicas bien definidas y grupos de cabeza de carbohidratos.

Superficies y soluciones de membranas codificadas

Las construcciones FSL tienen una amplia gama de usos y se han utilizado para modificar lo siguiente:

• Células – células sanguíneas , ^{[1] [2] [4 ] [6 ] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [17] [19] [21]} líneas de cultivo , ^[1] embriones , ^[1] espermatozoides ^[1]
• Virus ^[5] – influenza, ^[2] sarampión , varicela
• Organismos : parásitos , microbios , pez cebra ^[16]
• Liposomas – también micelas, partículas lipídicas ^[9]
• Superficies/fibras : membranas/fibras hidrófobas o hidrófilas, papel, ^[19] nitrocelulosa , algodón, seda, vidrio, teflón , sílice , perlas magnéticas (microesferas) ^[22] , etc.
• Soluciones : solución salina, plasma/suero, medios de cultivo.

Metodología para el uso de FSL (codificación)

Fig. 9 Preparación de los codecitos / codeviriones . Simplemente mezcle las células/viriones con una solución de FSL (que contenga 1 o más FSL) e incube durante 10 a 120 minutos a 37 °C (o a temperaturas tan bajas como 4 °C). Las construcciones se incorporarán espontáneamente a la membrana y no se requieren más pasos.

Las construcciones de FSL, cuando están en solución (solución salina ) y en contacto, se incorporarán espontáneamente a las membranas celulares y virales. ^[1] La metodología implica simplemente preparar una solución de construcciones de FSL en el rango de 1–1000 μg / mL . La concentración real dependerá de la construcción y la cantidad de construcción requerida en la membrana. Se agrega una parte de la solución de FSL a una parte de células (hasta un 100% de suspensión ) y se incuban a una temperatura establecida dentro del rango de 4–37 °C (39–99 °F) dependiendo de la compatibilidad de temperatura de las células que se están modificando. Cuanto mayor sea la temperatura, más rápida será la tasa de inserción de FSL en la membrana. Para los glóbulos rojos, a 37 °C de incubación durante 2 horas se logra >95% de inserción consiguiendo al menos un 50% de inserción en 20 minutos. En general, el tiempo de inserción de FSL de 4 horas a temperatura ambiente o 20 horas a 4 °C arroja resultados similares a 1 hora a 37 °C para FSL basados ​​en carbohidratos que se insertan en glóbulos rojos. ^[1] No es necesario lavar los kodecitos o kodeviriones resultantes, sin embargo, esta opción debe considerarse si se utiliza un exceso de construcción de FSL en el proceso de codificación.

Aplicaciones

Los constructos FSL Kode se han utilizado para investigación y desarrollo de productos de diagnóstico y actualmente se están investigando como posibles agentes terapéuticos .

Codecitos

Los FSL se han utilizado para crear codecitos de glóbulos rojos humanos que se han utilizado para detectar e identificar aloanticuerpos de grupos sanguíneos ^{[13] [14] [15]} como imitadores del subgrupo ABO , ^[11] sistemas de control de calidad ABO, ^[4] kits de enseñanza serológica ^[12] y un diagnóstico de sífilis . ^[21] Los codecitos también han demostrado que FSL-FLRO4 es un reactivo adecuado para etiquetar glóbulos rojos empaquetados (PRBC) en cualquier momento durante el almacenamiento de rutina y buscan facilitar el desarrollo de inmunoensayos y modelos de transfusión enfocados en abordar los mecanismos involucrados en la inmunomodulación relacionada con la transfusión (TRIM). ^[17] Los codecitos murinos se han utilizado experimentalmente para determinar la supervivencia celular in vivo , ^{[10] y crear} reacciones de transfusión modelo . ^{[9] [10] Los codecitos de pez cebra se han utilizado para determinar la migración celular} in vivo en tiempo real . ^[16] Los codecitos se han utilizado para crear diagnósticos de influenza. ^[2] Los códecitos modificados con FSL-GB3 no pudieron ser infectados por el virus VIH . ^{[7] [23]}

Codeviriones

Los kodeviriones son virus modificados por FSL. Se han utilizado varias construcciones de kode FSL para etiquetar virus y facilitar su visualización por citometría de flujo ^[5] y para rastrear su distribución en tiempo real en modelos animales. ^[5] También se han utilizado para modificar la superficie de los virus con la intención de utilizarlos como diana para adherirse a tumores ( oncolíticos ). ^[5]

Codesomas

Los kodesomas son liposomas que han sido decorados con construcciones FSL Kode. Estos se han utilizado para depositar construcciones FSL en microplacas para crear ensayos de diagnóstico . También tienen potencial para uso terapéutico. ^[24]

Soluciones codificadas

Estas son soluciones que contienen construcciones FSL Kode donde la construcción existirá como una dispersión microcelular clara. FSL-GB3 como solución/gel se ha utilizado para inhibir la infección por VIH ^[7] y para neutralizar la toxina Shiga . ^[7] El grupo sanguíneo A de FSL como solución se ha utilizado para neutralizar anticuerpos circulantes en un modelo de ratón y permitir la transfusión de grupo sanguíneo A incompatible ( kodecitos murinos ). ^[9] Este experimento modelo se utilizó para demostrar el potencial de los FSL para neutralizar anticuerpos circulantes y permitir la transfusión de sangre o el trasplante de órganos incompatibles . ^[19]

Superficies codificadas

Fig. 10 Las construcciones FSL se pueden imprimir con una impresora de inyección de tinta de escritorio estándar directamente sobre papel para crear inmunoensayos . La imagen es un ejemplo típico de un inmunoensayo enzimático (EIA) impreso con inyección de tinta donde se imprimieron 12 construcciones FSL diferentes como códigos de identificación en papel y luego se hicieron reaccionar contra diferentes muestras. La actividad de anticuerpos en las muestras se puede identificar por la aparición de palabras que identifican el antígeno objetivo. Un cartucho de inyección de tinta vacío se llena con una construcción FSL y se imprimen palabras, códigos de barras o gráficos. Se adhiere una plantilla Perspex a la superficie para crear pocillos de reacción . El método es entonces un procedimiento EIA estándar , pero no se requiere bloquear el suero y se puede utilizar suero sin diluir. Un procedimiento EIA típico es el siguiente: agregar suero, incubar, lavar por inmersión, agregar anticuerpo de detección EIA secundario , incubar, lavar, agregar sustrato precipitante NBT / BCIP y detener la reacción cuando se revela por lavado. El resultado es estable durante años.

Todas las construcciones FSL Kode se dispersan en agua y, por lo tanto, son compatibles con impresoras de inyección de tinta . Las construcciones FSL se pueden imprimir con una impresora de inyección de tinta de escritorio estándar directamente sobre papel para crear inmunoensayos. ^[19] Un cartucho de tinta vacío se llena con una construcción FSL y se imprimen palabras, códigos de barras o gráficos. Se adhiere una plantilla de Perspex a la superficie para crear pocillos de reacción. El método es entonces un procedimiento EIA estándar , pero no se requiere el bloqueo del suero y se puede utilizar suero sin diluir. Un procedimiento típico es el siguiente: agregar suero, incubar, lavar por inmersión, agregar conjugado EIA secundario, incubar, lavar, agregar sustrato precipitante NBT / BCIP y detener la reacción cuando se revela por lavado (Fig. 9) . El resultado es estable durante años.

Véase también

• Codevirion
• Código de citación

Enlaces externos

• Construcciones FSL: un método simple para modificar superficies de células y viriones con una variedad de marcadores biológicos sin afectar su viabilidad – Artículo de video gratuito de Journal of Visualised Experiments (JOVE)
• [1] kodecyte.org - el recurso académico para la tecnología Kode

Referencias

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