En neurociencia , la inactivación de bolas y cadenas es un modelo para explicar el mecanismo de inactivación rápida de los canales iónicos dependientes de voltaje . El proceso también se llama inactivación de tapa con bisagras o inactivación tipo N. Un canal iónico dependiente de voltaje puede estar en tres estados: abierto, cerrado o inactivado. El estado inactivado se logra principalmente mediante una inactivación rápida, mediante la cual un canal pasa rápidamente de un estado abierto a uno inactivado. El modelo propone que el estado inactivado, que es estable y no conductor, es causado por el bloqueo físico del poro. El bloqueo es causado por una "bola" de aminoácidos conectada a la proteína principal por una cadena de residuos en el lado citoplasmático de la membrana. La bola entra en el canal abierto y se une al vestíbulo interior hidrofóbico dentro del canal. Este bloqueo provoca la inactivación del canal al detener el flujo de iones . [1] [2] Este fenómeno se ha estudiado principalmente en los canales de potasio y en los canales de sodio . [3]
La evidencia inicial de la inactivación de bolas y cadenas llegó en 1977 con el trabajo de Clay Armstrong y Francisco Bezanilla . [4] La sugerencia de una base física para la no conductancia provino de experimentos en axones de calamares gigantes , que demostraron que el tratamiento interno con pronasa interrumpió el fenómeno de inactivación. Esto sugirió un mecanismo físico limitado para la inactivación, ya que se infirió que la pronasa degradaba el bloqueador del canal y abolía el proceso de inactivación. Estos experimentos también demostraron que la inactivación sólo puede ocurrir después de la apertura del canal. Esto se hizo hiperpolarizando la membrana, provocando la apertura del canal y observando un retraso en la inactivación. No se observó inactivación cuando la membrana estaba despolarizada (cerrada). Se descubrió que la introducción de tetraetilamonio (TEA) en el lado intracelular del canal imita la inactivación en canales no inactivantes. [5] El bloqueo del canal por TEA es mutuamente excluyente con el bloqueo mediado por péptidos, lo que sugiere que TEA compite por un sitio de unión de inactivación . [6]
Los experimentos de mutagénesis han identificado una cadena intracelular de aminoácidos como principales candidatos para el bloqueador de poros. [5] La secuencia precisa de aminoácidos que forma la bola bloqueadora de canales en los canales de potasio se identificó mediante la creación de un péptido sintético . El péptido se construyó basándose en la secuencia de un residuo de 20 aminoácidos de la proteína Shaker ShB de Drosophila melanogaster y se aplicó en el lado intracelular de un canal no inactivante en ovocitos de Xenopus . El péptido restauró la inactivación del canal, brindando mayor apoyo al modelo de bola y cadena. En las proteínas β 2 , los primeros tres residuos después de la metionina inicial han sido identificados como esenciales para la inactivación. Los residuos iniciales tienen un motivo secuencial de fenilalanina , isoleucina y triptófano sin los cuales no se produce la inactivación. La modificación de los residuos posteriores altera la velocidad y la eficacia de la inactivación sin abolirla. [7]
Más recientemente, los estudios de resonancia magnética nuclear en los canales BK de ovocitos de Xenopus han arrojado más luz sobre las propiedades estructurales del dominio de bolas y cadenas. [8] La introducción de la subunidad β KCNMB2 en el lado citoplásmico de un canal no inactivante restableció la inactivación, conforme al comportamiento esperado de una proteína de tipo bola y cadena. El análisis de RMN mostró que el dominio de la bola está compuesto por los residuos 1 a 17 y la región de la cadena de los residuos 20 a 45. Los tres aminoácidos del medio constituyen una región conectora flexible entre las dos regiones funcionales. La bola está en el extremo N de la subunidad β y consta de una parte desordenada (residuos 1 a 10) y un motivo de hélice en bucle formado por un bloque de aminoácidos que se extiende desde la serina en la posición 11 hasta el aspartato en la posición 16. La estructura del dominio de la cadena es una estructura de hélice alfa de 4 vueltas .
Los dominios de bolas y cadenas están en el lado citoplasmático del canal. Los estudios estructurales más precisos se han realizado en los canales de potasio Shaker , en los que se han identificado los residuos precisos implicados en el proceso. Los primeros 19 aminoácidos del extremo N constituyen el dominio de bola. Este está formado por 11 aminoácidos hidrófobos , 8 hidrófilos y 4 de carga positiva. [9] Los siguientes 60 aminoácidos constituyen el dominio de la cadena. Modificar los aminoácidos de la pelota conservando sus propiedades químicas no altera el mecanismo de inactivación. Esto sugiere que la bola ocluye el canal mediante unión electrostática en lugar de covalente . [10] Los estudios estructurales han demostrado que el poro interno del canal de potasio es accesible sólo a través de hendiduras laterales entre los dominios citoplasmáticos de las cuatro subunidades α , en lugar de desde una ruta central como se pensaba anteriormente. [11] El dominio de la bola ingresa al canal a través de las ranuras laterales y se une a un sitio de unión en lo profundo de la cavidad central . Este proceso implica un cambio conformacional , que permite que el bloqueador de cadena y bolas se alargue y alcance el centro interno del canal. [12]
Se cree que una región cargada positivamente entre los dominios III y IV de los canales de sodio actúa de manera similar. [9] La región esencial para la inactivación de los canales de sodio es una secuencia de cuatro aminoácidos formada por isoleucina , fenilalanina , metionina y treonina (IFMT). [13] T y F interactúan directamente con el sitio de acoplamiento en el poro del canal. [14] Cuando los canales de sodio dependientes de voltaje se abren , el segmento S4 se mueve hacia afuera del canal y hacia el lado extracelular. Esto expone residuos hidrofóbicos en los segmentos S4 y S5 que interactúan con la bola de inactivación. La fenilalanina de la pelota interactúa con la alanina en los segmentos S4-S5 del dominio III y la asparagina en los segmentos S4-S5 del dominio IV. [15] Esto explica por qué la inactivación sólo puede ocurrir una vez que el canal está abierto.
También hay hendiduras laterales en los canales de sodio, [16] lo que sugiere que la ruta de acceso al dominio de la bola puede ser similar.
Existe una distinción entre inactivación directa e inactivación en dos pasos. La inactivación directa, que ocurre en los canales de potasio Shaker , resulta del bloqueo directo del canal por la proteína bola, mientras que la inactivación en dos pasos, que se cree que ocurre en los canales BK , requiere un paso de unión intermedio. [17]
El mecanismo de inactivación de bolas y cadenas también es distinto del bloqueo dependiente de voltaje por moléculas intracelulares o regiones peptídicas de las subunidades beta4 en los canales de sodio . [18] Cuando estos bloqueos contribuyen a la inactivación del canal de sodio después de su apertura, la repolarización de la membrana invierte el bloqueo y puede provocar una corriente resurgente: un flujo de iones entre el desbloqueo y el cierre del canal. [19]
Los canales de potasio tienen una característica adicional en el extremo N que hace que los canales no puedan inactivarse. El dominio de prevención de inactivación (NIP) de tipo N contrarresta el efecto de la bola peptídica. Los canales que contienen el dominio NIP se comportan como canales mutados no inactivantes, ya que no tienen actividad de inactivación. [20] Se cree que el efecto es estequiométrico , ya que la introducción gradual de bolas sintéticas sin ataduras en el citoplasma finalmente restaura la inactivación. [21]
La interacción entre apertura e inactivación controla el patrón de activación de una neurona al cambiar la velocidad y la cantidad de flujo de iones a través de los canales. Los canales iónicos dependientes de voltaje se abren tras la despolarización de la membrana celular . Esto crea una corriente causada por el flujo de iones a través del canal. Poco después de abrirse, el canal es bloqueado por la bola peptídica. La subunidad β1 ayuda a la recuperación de la inactivación, [22] mientras que la β2 acelera la inactivación. [23] Las subunidades β también pueden interferir con los dominios de bolas y cadenas bloqueando su entrada al canal. Esto conduce a corrientes persistentes, causadas por la entrada continua de iones. La subunidad β3 puede aumentar la corriente persistente en ciertos canales de sodio. [13]
Las diferencias en las corrientes persistentes y resurgentes se han implicado en ciertos trastornos neurológicos y neuromusculares humanos . En la epilepsia , las mutaciones en los genes de los canales de sodio retrasan la inactivación. Esto hace que el canal permanezca abierto durante más tiempo y, por tanto, una activación neuronal más duradera. [24] Se observan niveles más altos de corriente persistente en la epilepsia. Esta estimulación neuronal constante y de bajo nivel se ha relacionado con las convulsiones propias de este trastorno. [25]
Las anomalías de inactivación también se han relacionado con el síndrome de Brugada . Las mutaciones en los genes que codifican la subunidad α en los canales de sodio cardíacos afectan la inactivación. Estos aumentan la corriente persistente al interferir con la inactivación, aunque diferentes mutaciones tienen efectos opuestos en la velocidad de inactivación. [26]
Las mutaciones en la subunidad α de los músculos esqueléticos también están asociadas con la miotonía . La hiperexcitación muscular característica de la miotonía está causada principalmente por la presencia de canales de sodio que no se inactivan, provocando niveles elevados de corriente persistente en los músculos. [27]