La termodinámica de los ácidos nucleicos es el estudio de cómo la temperatura afecta la estructura de los ácidos nucleicos del ADN de doble cadena (dsDNA). La temperatura de fusión ( Tm ) se define como la temperatura a la que la mitad de las cadenas de ADN están en estado de bobina aleatoria o de cadena sencilla (ssDNA). La Tm depende de la longitud de la molécula de ADN y de su secuencia de nucleótidos específica . Cuando el ADN se encuentra en un estado en el que sus dos cadenas están disociadas (es decir, la molécula de dsDNA existe como dos cadenas independientes), se dice que ha sido desnaturalizado por la alta temperatura.
La hibridación es el proceso de establecer una interacción no covalente , específica de secuencia, entre dos o más cadenas complementarias de ácidos nucleicos en un único complejo, que en el caso de dos cadenas se denomina dúplex . Los oligonucleótidos , el ADN o el ARN se unirán a su complemento en condiciones normales, por lo que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán entre sí fácilmente. Para reducir la diversidad y obtener los complejos más preferidos energéticamente, se utiliza una técnica llamada recocido en la práctica de laboratorio. Sin embargo, debido a las diferentes geometrías moleculares de los nucleótidos, una sola inconsistencia entre las dos cadenas hará que la unión entre ellas sea menos favorable energéticamente. Medir los efectos de la incompatibilidad de bases cuantificando la temperatura a la que se recocen dos cadenas puede proporcionar información sobre la similitud en la secuencia de bases entre las dos cadenas que se están recociendo. Los complejos pueden disociarse mediante desnaturalización térmica , también conocida como fusión. En ausencia de factores externos negativos, los procesos de hibridación y fusión pueden repetirse en sucesión indefinidamente, lo que sienta las bases para la reacción en cadena de la polimerasa . Lo más común es que se formen los pares de bases nucleicas A=T y G≡C, siendo esta última la más estable.
La desnaturalización del ADN , también llamada fusión del ADN, es el proceso por el cual el ácido desoxirribonucleico bicatenario se desenrolla y se separa en cadenas monocatenarias mediante la ruptura de las atracciones de apilamiento hidrofóbicas entre las bases. Véase Efecto hidrofóbico . Ambos términos se utilizan para referirse al proceso que ocurre cuando se calienta una mezcla, aunque "desnaturalización" también puede referirse a la separación de las cadenas de ADN inducida por sustancias químicas como la formamida o la urea . [1]
El proceso de desnaturalización del ADN se puede utilizar para analizar algunos aspectos del ADN. Debido a que el emparejamiento de bases citosina/guanina es generalmente más fuerte que el emparejamiento de bases adenina/timina, la cantidad de citosina y guanina en un genoma se denomina contenido de GC y se puede estimar midiendo la temperatura a la que se funde el ADN genómico. [2] Las temperaturas más altas se asocian con un alto contenido de GC.
La desnaturalización del ADN también se puede utilizar para detectar diferencias de secuencia entre dos secuencias de ADN diferentes. El ADN se calienta y se desnaturaliza hasta el estado monocatenario, y la mezcla se enfría para permitir que las hebras se vuelvan a hibridar. Las moléculas híbridas se forman entre secuencias similares y cualquier diferencia entre esas secuencias dará como resultado una interrupción del apareamiento de bases. A escala genómica, los investigadores han utilizado el método para estimar la distancia genética entre dos especies, un proceso conocido como hibridación ADN-ADN . [3] En el contexto de una única región aislada de ADN, se pueden utilizar geles de gradiente desnaturalizantes y geles de gradiente de temperatura para detectar la presencia de pequeños desajustes entre dos secuencias, un proceso conocido como electroforesis en gel de gradiente de temperatura . [4] [5]
Los métodos de análisis de ADN basados en la temperatura de fusión tienen la desventaja de ser sustitutos para estudiar la secuencia subyacente; la secuenciación de ADN generalmente se considera un método más preciso.
El proceso de fusión del ADN también se utiliza en técnicas de biología molecular, en particular en la reacción en cadena de la polimerasa . Aunque la temperatura de fusión del ADN no es diagnóstica en la técnica, los métodos para estimar la Tm son importantes para determinar las temperaturas apropiadas para usar en un protocolo. Las temperaturas de fusión del ADN también se pueden utilizar como un indicador para igualar las intensidades de hibridación de un conjunto de moléculas, por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos de los microarreglos de ADN .
En genética , el término annealing (recocido) se refiere a secuencias complementarias de ADN o ARN monocatenario que se aparean mediante enlaces de hidrógeno para formar un polinucleótido bicatenario . Antes de que pueda producirse el annealing, puede ser necesario fosforilarlo mediante una enzima, como la quinasa, para permitir que se produzca el enlace de hidrógeno adecuado. El término annealing se utiliza a menudo para describir la unión de una sonda de ADN o la unión de un cebador a una cadena de ADN durante una reacción en cadena de la polimerasa . El término también se utiliza a menudo para describir la reformación ( renaturación ) de cadenas complementarias inversas que se separaron por calor (desnaturalizadas térmicamente). Las proteínas como RAD52 pueden ayudar al annealing del ADN. El annealing de cadenas de ADN es un paso clave en las vías de recombinación homóloga . En particular, durante la meiosis , el annealing de cadenas dependiente de la síntesis es una vía importante de recombinación homóloga.
El apilamiento es la interacción estabilizadora entre las superficies planas de bases adyacentes. El apilamiento puede ocurrir con cualquier cara de la base, es decir 5'-5', 3'-3' y viceversa. [7]
El apilamiento en moléculas de ácidos nucleicos "libres" se debe principalmente a la fuerza intermolecular , específicamente a la atracción electrostática entre anillos aromáticos, un proceso también conocido como apilamiento pi . En los sistemas biológicos con agua como disolvente, el efecto hidrofóbico contribuye y ayuda a la formación de una hélice. [8] El apilamiento es el principal factor estabilizador en la doble hélice del ADN. [9]
La contribución del apilamiento a la energía libre de la molécula se puede estimar experimentalmente observando el equilibrio de apilamiento doblado en el ADN mellado . Esta estabilización depende de la secuencia. [6] El grado de estabilización varía con las concentraciones de sal y la temperatura. [9]
Se utilizan varias fórmulas para calcular los valores de Tm . [10] [11] Algunas fórmulas son más precisas para predecir las temperaturas de fusión de los dúplex de ADN. [12] Para los oligonucleótidos de ADN, es decir, secuencias cortas de ADN, la termodinámica de la hibridación se puede describir con precisión como un proceso de dos estados. En esta aproximación se descuida la posibilidad de estados de unión parcial intermedios en la formación de un estado de doble cadena a partir de dos oligonucleótidos de cadena sencilla. Bajo este supuesto se pueden describir elegantemente los parámetros termodinámicos para formar el ácido nucleico de doble cadena AB a partir de los ácidos nucleicos de cadena sencilla A y B.
La constante de equilibrio para esta reacción es . Según la ecuación de Van´t Hoff, la relación entre la energía libre, Δ G , y K es Δ G° = - RT ln K , donde R es la constante de la ley de los gases ideales y T es la temperatura kelvin de la reacción. Esto da, para el sistema de ácidos nucleicos,
.
La temperatura de fusión, T m , se produce cuando la mitad del ácido nucleico bicatenario se ha disociado. Si no hay ácidos nucleicos adicionales presentes, entonces [A], [B] y [AB] serán iguales, e iguales a la mitad de la concentración inicial de ácido nucleico bicatenario, [AB] inicial . Esto da una expresión para el punto de fusión de un dúplex de ácido nucleico de
.
Como Δ G ° = Δ H ° - T Δ S °, T m también viene dada por
.
Los términos Δ H ° y Δ S ° se dan generalmente para la reacción de asociación y no para la de disociación (véase, por ejemplo, el método del vecino más próximo). Esta fórmula se convierte entonces en: [13]
, donde [B] total ≤ [A] total .
Como se mencionó, esta ecuación se basa en el supuesto de que solo dos estados intervienen en la fusión: el estado de doble cadena y el estado de bobina aleatoria. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden fundirse a través de varios estados intermedios. Para explicar un comportamiento tan complicado, se deben utilizar los métodos de la mecánica estadística , lo que es especialmente relevante para secuencias largas.
El párrafo anterior muestra cómo la temperatura de fusión y los parámetros termodinámicos (Δ G ° o Δ H ° y Δ S °) se relacionan entre sí. A partir de la observación de las temperaturas de fusión, se pueden determinar experimentalmente los parámetros termodinámicos. Viceversa, y esto es importante para las aplicaciones, cuando se conocen los parámetros termodinámicos de una secuencia de ácido nucleico dada, se puede predecir la temperatura de fusión. Resulta que, para los oligonucleótidos, estos parámetros se pueden aproximar bien mediante el modelo del vecino más cercano.
La interacción entre bases en diferentes cadenas depende en cierta medida de las bases vecinas. En lugar de tratar una hélice de ADN como una cadena de interacciones entre pares de bases , el modelo del vecino más cercano trata una hélice de ADN como una cadena de interacciones entre pares de bases "vecinos". [13] Por ejemplo, el ADN que se muestra a continuación tiene interacciones de vecino más cercano indicadas por las flechas.
![{\displaystyle K={\frac {[A][B]}{[AB]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/25ad2e8e20b03f9c7f894f16b221d1b3a14318a7)
![{\displaystyle \Delta G^{\circ }=-RT\ln {\frac {[A][B]}{[AB]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/da81847c399c4a9655e6fa28588e55e33b0d8267)
![{\displaystyle T_{m}=-{\frac {\Delta G^{\circ }}{R\ln {\frac {[AB]_{inicial}}{2}}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/de3cbd630bf8e7823ffe433ae15e5a00572eafaa)
![{\displaystyle T_{m}={\frac {\Delta H^{\circ }}{\Delta S^{\circ }-R\ln {\frac {[AB]_{inicial}}{2}} }}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/bb394a9f8745cc9251cea322cee7cf1426c8257a)
![{\displaystyle T_{m}={\frac {\Delta H^{\circ }}{\Delta S^{\circ }+R\ln([A]_{total}-[B]_{total} /2)}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/3022bc9d919a25a7c2d3018bbca5890f1348f321)
↓ ↓ ↓ ↓ ↓5' C-G-T-T-G-A 3'3' G-C-A-A-C-T 5'La energía libre de formación de este ADN a partir de las hebras individuales, Δ G °, se representa (a 37 °C) como
Δ G ° 37 (previsto) = Δ G ° 37 (iniciación C/G) + Δ G ° 37 (CG/GC) + Δ G ° 37 (GT/CA) + Δ G ° 37 (TT/AA) + Δ G ° 37 (TG/AC) + Δ G ° 37 (GA/CT) + Δ G ° 37 (Iniciación A/T)
A excepción del término de iniciación C/G, el primer término representa la energía libre del primer par de bases, CG, en ausencia de un vecino más cercano. El segundo término incluye tanto la energía libre de formación del segundo par de bases, GC, como la interacción de apilamiento entre este par de bases y el par de bases anterior. Los términos restantes se definen de manera similar. En general, la energía libre de formación de un dúplex de ácido nucleico es
,
donde representa la energía libre asociada con uno de los diez pares de nucleótidos vecinos más cercanos posibles, y representa su recuento en la secuencia.
Cada término Δ G ° tiene parámetros entálpicos, Δ H °, y entrópicos, Δ S °, por lo que el cambio en energía libre también está dado por
.
Se han determinado los valores de Δ H ° y Δ S ° para los diez pares de interacciones posibles. Se dan en la Tabla 1, junto con el valor de Δ G ° calculado a 37 °C. Utilizando estos valores, el valor de Δ G 37 ° para el dúplex de ADN que se muestra arriba se calcula en −22,4 kJ/mol. El valor experimental es −21,8 kJ/mol.
Los parámetros asociados a los diez grupos de vecinos que se muestran en la tabla 1 se determinan a partir de los puntos de fusión de dúplex de oligonucleótidos cortos. Resulta que solo ocho de los diez grupos son independientes.
El modelo del vecino más cercano se puede extender más allá de los pares Watson-Crick para incluir parámetros para interacciones entre desajustes y pares de bases vecinos. [14] Esto permite la estimación de los parámetros termodinámicos de secuencias que contienen desajustes aislados, como por ejemplo (flechas que indican desajuste)
↓↓↓5' G-G-A-C-T-G-A-C-G 3'3' C-C-T-G-G-C-T-G-C 5'Estos parámetros se han ajustado a partir de experimentos de fusión y se puede encontrar en la literatura una ampliación de la Tabla 1 que incluye los desajustes.
Una forma más realista de modelar el comportamiento de los ácidos nucleicos parecería ser la de tener parámetros que dependan de los grupos vecinos a ambos lados de un nucleótido, dando una tabla con entradas como "TCG/AGC". Sin embargo, esto implicaría alrededor de 32 grupos para el emparejamiento Watson-Crick e incluso más para las secuencias que contienen desajustes; la cantidad de experimentos de fusión de ADN necesarios para obtener datos confiables para tantos grupos sería inconvenientemente alta. Sin embargo, existen otros medios para acceder a los parámetros termodinámicos de los ácidos nucleicos: la tecnología de microarrays permite el monitoreo de la hibridación de decenas de miles de secuencias en paralelo. Estos datos, en combinación con la teoría de adsorción molecular, permiten la determinación de muchos parámetros termodinámicos en un solo experimento [15] e ir más allá del modelo del vecino más cercano [16] . En general, las predicciones del método del vecino más cercano concuerdan razonablemente bien con los resultados experimentales, pero existen algunas secuencias periféricas inesperadas que requieren más conocimientos. [16] Por último, también debemos mencionar la mayor precisión proporcionada por los ensayos de descompresión de moléculas individuales, que brindan una gran cantidad de nuevos conocimientos sobre la termodinámica de la hibridación del ADN y también sobre la validez del modelo del vecino más cercano. [17]
