La cromatografía de afinidad es un método para separar una biomolécula de una mezcla, basado en una interacción de unión macromolecular altamente específica entre la biomolécula y otra sustancia. El tipo específico de interacción de unión depende de la biomolécula de interés; Las interacciones de unión de antígeno y anticuerpo , enzima y sustrato , receptor y ligando , o proteína y ácido nucleico [1] se aprovechan con frecuencia para el aislamiento de diversas biomoléculas. La cromatografía de afinidad es útil por su alta selectividad y resolución de separación, [2] [3] en comparación con otros métodos cromatográficos.
La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de interacciones de unión específicas entre el analito de interés (normalmente disuelto en la fase móvil ) y un compañero de unión o ligando (inmovilizado en la fase estacionaria ). En un experimento típico de cromatografía de afinidad, el ligando se une a una matriz sólida e insoluble (generalmente un polímero como agarosa o poliacrilamida ) modificada químicamente para introducir grupos funcionales reactivos con los que el ligando puede reaccionar, formando enlaces covalentes estables. [4] La fase estacionaria se carga primero en una columna a la que se introduce la fase móvil. Las moléculas que se unen al ligando permanecerán asociadas a la fase estacionaria. Luego se aplica un tampón de lavado para eliminar las biomoléculas no objetivo interrumpiendo sus interacciones más débiles con la fase estacionaria, mientras que las biomoléculas de interés permanecerán unidas. Luego, las biomoléculas objetivo se pueden eliminar aplicando el llamado tampón de elución, que interrumpe las interacciones entre las biomoléculas objetivo unidas y el ligando. La molécula objetivo se recupera así en la solución eluyente. [5] [ página necesaria ]
La cromatografía de afinidad no requiere que se conozca el peso molecular, la carga, la hidrofobicidad u otras propiedades físicas del analito de interés, aunque el conocimiento de sus propiedades de unión es útil en el diseño de un protocolo de separación. [5] Los tipos de interacciones de unión comúnmente explotadas en los procedimientos de cromatografía de afinidad se resumen en la siguiente tabla.
La unión a la fase sólida se puede lograr mediante cromatografía en columna mediante la cual el medio sólido se empaqueta en una columna, la mezcla inicial se pasa a través de la columna para permitir la sedimentación, se pasa un tampón de lavado a través de la columna y el tampón de elución se aplica posteriormente a la columna y se recoge. . Estos pasos generalmente se realizan a presión ambiente. Alternativamente, la unión se puede lograr usando un tratamiento por lotes, por ejemplo, agregando la mezcla inicial a la fase sólida en un recipiente, mezclando, separando la fase sólida, eliminando la fase líquida, lavando, volviendo a centrifugar, agregando el tampón de elución, volver a centrifugar y retirar el eluido.
A veces se emplea un método híbrido de modo que la unión se realiza mediante el método discontinuo, pero la fase sólida con la molécula objetivo unida se empaqueta en una columna y el lavado y la elución se realizan en la columna.
Los ligandos utilizados en cromatografía de afinidad se obtienen de fuentes tanto orgánicas como inorgánicas. Ejemplos de fuentes biológicas son proteínas séricas, lectinas y anticuerpos. Las fuentes inorgánicas son el ácido morónico, los quelatos metálicos y los colorantes de triazina. [7]
También se ha desarrollado un tercer método, la absorción en lecho expandido, que combina las ventajas de los dos métodos mencionados anteriormente. Las partículas de la fase sólida se colocan en una columna donde la fase líquida se bombea desde el fondo y sale por la parte superior. La gravedad de las partículas asegura que la fase sólida no salga de la columna con la fase líquida.
Las columnas de afinidad se pueden eluir cambiando las concentraciones de sal, el pH, el pI, la carga y la fuerza iónica directamente o mediante un gradiente para resolver las partículas de interés.
Más recientemente, se han desarrollado configuraciones que emplean más de una columna en serie. La ventaja en comparación con las configuraciones de una sola columna es que el material de resina se puede cargar completamente, ya que el producto no aglutinante pasa directamente a una columna consecutiva con material de columna nuevo. Estos procesos cromatográficos se conocen como cromatografía periódica en contracorriente (PCC). De este modo se pueden reducir drásticamente los costes de resina por cantidad de producto producido. Dado que una columna siempre se puede eluir y regenerar mientras la otra columna está cargada, dos columnas ya son suficientes para aprovechar todas las ventajas. [8] Las columnas adicionales pueden brindar flexibilidad adicional para los tiempos de elución y regeneración, a costa de equipos adicionales y costos de resina.
La cromatografía de afinidad se puede utilizar en diversas aplicaciones, incluida la purificación de ácidos nucleicos, la purificación de proteínas [9] a partir de extractos libres de células y la purificación de sangre.
Mediante el uso de cromatografía de afinidad, se pueden separar las proteínas que se unen a un determinado fragmento de las proteínas que no se unen a ese fragmento específico. [10] Debido a que esta técnica de purificación se basa en las propiedades biológicas de la proteína necesaria, es una técnica útil y las proteínas se pueden purificar en muchas ocasiones en un solo paso. [11] [ página necesaria ]
Existen muchos medios de afinidad diferentes para una variedad de usos posibles. [12] [9] [13] Brevemente, están activados/funcionalizados (generalizados) y funcionan como espaciadores funcionales, matrices de soporte y eliminan la manipulación de reactivos tóxicos.
Los medios de aminoácidos se utilizan con una variedad de proteínas séricas, proteínas, péptidos y enzimas, así como con ARNr y ADNbc. Los medios de biotina avidina se utilizan en el proceso de purificación de biotina/avidina y sus derivados.
Los enlaces de carbohidratos se utilizan con mayor frecuencia con glicoproteínas o cualquier otra sustancia que contenga carbohidratos; Los carbohidratos se usan con lectinas, glicoproteínas o cualquier otra proteína metabolito de carbohidratos. Los medios de ligando colorante no son específicos pero imitan sustratos biológicos y proteínas. El glutatión es útil para la separación de proteínas recombinantes marcadas con GST. La heparina es un ligando de afinidad generalizada y es más útil para la separación de proteínas de la coagulación plasmática, junto con enzimas de ácidos nucleicos y lipasas.
Los medios de interacción hidrófobos se utilizan más comúnmente para apuntar a proteínas y grupos carboxilo libres.
Los medios de inmunoafinidad (detallados a continuación) utilizan la alta especificidad de antígenos y anticuerpos para separarse; la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados se detalla más adelante y utiliza interacciones entre iones metálicos y proteínas (generalmente marcadas especialmente) para separar; nucleótido/coenzima que trabaja para separar deshidrogenasas, quinasas y transaminasas.
Los ácidos nucleicos funcionan para atrapar ARNm, ADN, ARNr y otros ácidos nucleicos/oligonucleótidos. El método de proteína A/G se utiliza para purificar inmunoglobulinas.
Los medios especiales están diseñados para una clase o tipo específico de proteína/coenzima; este tipo de medio solo funcionará para separar una proteína o coenzima específica.
Otro uso del procedimiento es la purificación por afinidad de anticuerpos del suero sanguíneo. Si se sabe que el suero contiene anticuerpos contra un antígeno específico (por ejemplo, si el suero proviene de un organismo inmunizado contra el antígeno en cuestión), entonces puede usarse para la purificación por afinidad de ese antígeno. Esto también se conoce como cromatografía de inmunoafinidad. Por ejemplo, si un organismo es inmunizado contra una proteína de fusión GST, producirá anticuerpos contra la proteína de fusión y posiblemente también anticuerpos contra la etiqueta GST. Luego, la proteína puede acoplarse covalentemente a un soporte sólido como la agarosa y usarse como ligando de afinidad en purificaciones de anticuerpos a partir de suero inmune.
Para mayor detalle, la proteína GST y la proteína de fusión GST se pueden acoplar cada una por separado. Inicialmente se permite que el suero se una a la matriz de afinidad de GST. Esto eliminará los anticuerpos contra la parte GST de la proteína de fusión. Luego se separa el suero del soporte sólido y se le permite unirse a la matriz de proteína de fusión GST. Esto permite que cualquier anticuerpo que reconozca el antígeno sea capturado en el soporte sólido. La elución de los anticuerpos de interés se logra con mayor frecuencia utilizando un tampón de pH bajo , como la glicina de pH 2,8. El eluato se recoge en un tampón tris o fosfato neutro para neutralizar el tampón de elución de bajo pH y detener cualquier degradación de la actividad del anticuerpo. Este es un buen ejemplo, ya que la purificación por afinidad se utiliza para purificar la proteína de fusión GST inicial, eliminar los anticuerpos anti-GST indeseables del suero y purificar el anticuerpo objetivo.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden seleccionar para unirse a proteínas con gran especificidad, donde la proteína se libera en condiciones bastante suaves. Esto puede resultar útil para futuras investigaciones. [14]
A menudo se emplea una estrategia simplificada para purificar anticuerpos generados contra antígenos peptídicos . Cuando los antígenos peptídicos se producen sintéticamente, se añade un residuo de cisteína terminal en el extremo N o C del péptido. Este residuo de cisteína contiene un grupo funcional sulfhidrilo que permite que el péptido se conjugue fácilmente con una proteína transportadora (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH)). El mismo péptido que contiene cisteína también se inmoviliza en una resina de agarosa a través del residuo de cisteína y luego se usa para purificar el anticuerpo.
La mayoría de los anticuerpos monoclonales se han purificado mediante cromatografía de afinidad basada en proteína A o proteína G específica de inmunoglobulina , derivada de bacterias. [15]
La cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales inmovilizados en una columna monolítica se ha utilizado con éxito para capturar vesículas extracelulares (p. ej., exosomas y exómeros) del plasma sanguíneo humano dirigiéndose a las tetraspaninas y las integrinas que se encuentran en la superficie de los vehículos eléctricos. [16] [17]
La cromatografía de inmunoafinidad es también la base de las tiras reactivas inmunocromatográficas (TIC), que proporcionan un medio rápido de diagnóstico en la atención al paciente. Utilizando las TIC, un técnico puede tomar una determinación junto a la cama del paciente, sin necesidad de un laboratorio. [18] La detección de las TIC es muy específica del microbio que causa una infección. [19]
La cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) se basa en el enlace covalente coordinado específico de los aminoácidos, particularmente la histidina, con los metales. Esta técnica funciona permitiendo que las proteínas con afinidad por los iones metálicos sean retenidas en una columna que contiene iones metálicos inmovilizados, como cobalto, níquel o cobre para la purificación de proteínas o péptidos que contienen histidina, hierro, zinc o galio para la purificación. de proteínas o péptidos fosforilados. Muchas proteínas naturales no tienen afinidad por los iones metálicos, por lo que se puede utilizar la tecnología del ADN recombinante para introducir dicha etiqueta proteica en el gen correspondiente. Los métodos utilizados para eluir la proteína de interés incluyen cambiar el pH o agregar una molécula competitiva, como el imidazol . [20] [21]
Posiblemente el uso más común de la cromatografía de afinidad sea para la purificación de proteínas recombinantes. Las proteínas con una afinidad conocida se etiquetan con el fin de ayudar a su purificación. La proteína puede haber sido modificada genéticamente para permitir su selección por afinidad de unión; esto se conoce como proteína de fusión. Las etiquetas de proteínas incluyen hexahistidina ( His ), glutatión -S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP) y la etiqueta CL7 variante colicina E7. Las etiquetas de histidina tienen afinidad por los iones de níquel , cobalto , zinc , cobre y hierro que han sido inmovilizados formando enlaces covalentes coordinados con un quelante incorporado en la fase estacionaria. Para la elución se utiliza una cantidad en exceso de un compuesto capaz de actuar como ligando de un ion metálico, como el imidazol . GST tiene afinidad por el glutatión que está disponible comercialmente inmovilizado como glutatión agarosa. Durante la elución, se utiliza un exceso de glutatión para desplazar la proteína marcada. CL7 tiene afinidad y especificidad por la proteína de inmunidad 7 (Im7), que está disponible comercialmente inmovilizada como resina de agarosa Im7. Para la elución, se aplica una proteasa activa y específica del sitio a la resina Im7 para liberar la proteína sin etiquetas. [22]
La cromatografía de afinidad con lectinas es una forma de cromatografía de afinidad en la que se utilizan lectinas para separar componentes dentro de la muestra. Las lectinas, como la concanavalina A , son proteínas que pueden unirse a moléculas de carbohidratos específicas de alfa-D-manosa y alfa-D-glucosa. Algunas moléculas de carbohidratos comunes que se utilizan en la cromatografía de afinidad de lectinas son Con A-Sepharose y WGA-agarosa. [23] Otro ejemplo de lectina es la aglutinina de germen de trigo que se une a la DN-acetil-glucosamina. [24] La aplicación más común es separar glicoproteínas de proteínas no glicosiladas, o una glicoforma de otra glicoforma. [25] Aunque existen varias formas de realizar cromatografía de afinidad de lectinas, el objetivo es extraer un ligando de azúcar de la proteína deseada. [23]
Otro uso de la cromatografía de afinidad es la purificación de proteínas específicas utilizando una matriz de gel que es exclusiva de una proteína específica. Por ejemplo, la purificación de la β-galactosidasa de E. coli se logra mediante cromatografía de afinidad usando p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa como matriz de afinidad. La p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa se utiliza como matriz de afinidad porque contiene un grupo galactopiranosilo, que sirve como un buen sustrato análogo para la β-galactosidasa de E. coli. Esta propiedad permite que la enzima se una a la fase estacionaria de la matriz de afinidad y la β-galactosidasa se eluya agregando concentraciones crecientes de sal a la columna. [26]
La fosfatasa alcalina de E. coli se puede purificar utilizando una matriz de DEAE-celulosa. A. fosfatasa tiene una ligera carga negativa, lo que le permite unirse débilmente a los grupos amino cargados positivamente en la matriz. Luego, la enzima se puede eluir añadiendo tampón con concentraciones de sal más altas. [27]
La cromatografía de afinidad con boronato consiste en utilizar ácido borónico o boronatos para eluir y cuantificar cantidades de glicoproteínas . Las adaptaciones clínicas han aplicado este tipo de cromatografía para determinar la evaluación a largo plazo de pacientes diabéticos mediante el análisis de su hemoglobina glucosilada . [24]
La purificación por afinidad de la contaminación por albúmina y macroglobulina es útil para eliminar el exceso de albúmina y la contaminación por α 2 -macroglobulina al realizar espectrometría de masas. En la purificación por afinidad de albúmina sérica, el material estacionario utilizado para recolectar o atraer proteínas séricas puede ser Cibacron Blue-Sepharose. Luego las proteínas séricas pueden eluirse del adsorbente con un tampón que contenga tiocianato (SCN − ). [28]
La cromatografía de afinidad débil [29] ( WAC ) es una técnica de cromatografía de afinidad para la detección de afinidad en el desarrollo de fármacos. [30] [31] WAC es una técnica de cromatografía líquida basada en afinidad que separa compuestos químicos en función de sus diferentes afinidades débiles con un objetivo inmovilizado. Cuanto mayor sea la afinidad de un compuesto hacia el objetivo, más tiempo permanecerá en la unidad de separación, y esto se expresará como un mayor tiempo de retención. La medida de afinidad y la clasificación de afinidad se pueden lograr procesando los tiempos de retención obtenidos de los compuestos analizados. La cromatografía de afinidad es parte de un conjunto más amplio de técnicas utilizadas en la identificación de dianas farmacológicas basadas en quimioproteómica .
La tecnología WAC se demuestra frente a varios objetivos proteicos diferentes : proteasas , quinasas , chaperonas y objetivos de interacción proteína-proteína (PPI). Se ha demostrado que WAC es más eficaz que los métodos establecidos para la detección basada en fragmentos. [31]
La cromatografía de afinidad fue concebida y desarrollada por primera vez por Pedro Cuatrecasas y Meir Wilchek . [32] [33]
La cromatografía de afinidad es una técnica novedosa ideada por Cuatrecasas y Wilchek