La cromatografía de afinidad de ligando-colorante es una de las técnicas de cromatografía de afinidad que se utilizan para la purificación de proteínas de una mezcla compleja. Es como la cromatografía general, pero se utilizan colorantes para aplicarlos sobre una matriz de soporte de una columna como fase estacionaria que permitirá que se unan una variedad de proteínas con sitios activos similares, lo que se conoce como pseudoafinidad. [1] Los colorantes sintéticos se utilizan para imitar la unión de sustratos o cofactores a los sitios activos de las proteínas, que se pueden mejorar aún más para dirigirse a proteínas más específicas. A continuación, se realiza un lavado, el proceso de eliminación de otras moléculas no objetivo, y luego se eluyen las proteínas objetivo cambiando el pH o manipulando la concentración de sal. La columna se puede reutilizar muchas veces debido a la estabilidad de los colorantes inmovilizados. Se puede llevar a cabo de forma convencional utilizándola como columna empaquetada o en una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). [2]
El descubrimiento de la capacidad de unión de un colorante y un ligando se debe a un colorante azul llamado dextrano azul. El colorante azul se utiliza como marcador de volumen vacío (V0 ) para una columna de filtración en gel. Se ha demostrado que el colorante tiene la propiedad de unirse a ciertas proteínas, como la piruvato quinasa, y eluirse con el volumen vacío. Más tarde, se descubrió que el "azul cibacrón FG3-A", un colorante reactivo que se une al dextrano, es responsable de la interacción con las proteínas. [1] [2]
Los colorantes se inmovilizan en la matriz de la columna de manera efectiva, ya que generalmente los colorantes se unen a un anillo de monoclorotriazina o diclorotriazina ( colorante de triazina ). Este tipo de colorantes funciona especialmente bien en una matriz de soporte con grupo hidroxilo . [3] La matriz de soporte comúnmente utilizada sería agarosa reticulada (sepharosa), sephadex, poliacrilamida y sílice.
Un ejemplo de inmovilización de enlaces de triazina es la sefarosa azul, que resulta de la unión covalente del azul de cibacrón FG3-A con monoclorotriazina al grupo OH de la sefarosa. Esta reacción forma un enlace éter y también cloruro de hidrógeno. [4]
C29H20ClN7O11S3 + C24H38O19 → C53H57N7O30S3 + HCl
Azul de cibacrón FG3-A + sefarosa → Sefarosa azul + HCl
Los colorantes que se utilizan en este tipo de cromatografía son económicos y generalmente se consiguen porque proceden de la industria textil y se denominan colorantes reactivos . Contienen cromóforos que suelen estar unidos a un anillo de triazina. En la industria textil, los colorantes reactivos se utilizan para teñir materiales como el algodón, que es celulosa.
Los colorantes reactivos de uso común para cromatografía se pueden clasificar según su nombre de índice de color o grupo funcional. Cabe señalar que cada empresa tiene diferentes nombres comerciales y fórmulas ligeramente diferentes de los colorantes reactivos. Por lo general, se encuentran disponibles comercialmente con sefarosa como matriz de soporte en forma de columnas empaquetadas.
El azul de cibacrón F3GA, azul de Procion HB o azul reactivo 2 es un antagonista de los receptores purinérgicos , como el purinoceptor P2Y, y también un antagonista de los canales del receptor de ATP. Tiene una fórmula de C 29 H 20 ClN 7 O 11 S 3 y un peso molecular de 774,2 g/mol. [5] El azul de cibacrón es soluble en agua y DMSO, pero insoluble en etanol. En agua, la concentración saturada se alcanza a 12,92 mM con la ayuda de sonicación. El azul de cibacrón F3GA tiene una amplia especificidad para las proteínas de unión a nucleótidos o simplemente una unión electrostática de estereoselectividad. Se puede utilizar para purificar interferones, deshidrogenasas, quinasas y albúmina sérica. Por ejemplo, la purificación de interferón a partir de un extracto de fibroblastos gingivales humanos utilizando Cibacron Blue F3G-A sobre poli(2-hidroxietil metacrilato), la matriz de soporte, en forma de criogeles, ha demostrado una pureza del 97,6 % del interferón. [6]
El Blue MX-R o Reactive Blue 4 tiene una fórmula de C 23 H 14 Cl 2 N 6 O 8 S 2 y un peso molecular de 637,4 g/mol. Contiene un anillo de diclorotriazina en el cromóforo a diferencia del Cibacron Blue F3GA. Para una purificación de proteínas a gran escala, el Blue MX-R se puede utilizar para purificar proteínas como la lactato deshidrogenasa (LDH). [2] En la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) utilizando Blue MX-R inmovilizado en perlas de poli(metacrilato de glicidilo-co-dimetacrilato de etileno), se observó que separaba la lisozima y la albúmina de suero bovino (BSA), lisozima purificada de la albúmina de pollo. [7]
El Rojo HE-3B o Rojo Reactivo 120 tiene una fórmula de C 44 H 30 Cl 2 N 14 O 20 S 6 y un peso molecular de 1338,1 g/mol, y contiene dos anillos de monoclorotriazina. Es muy soluble en agua. [8] La capacidad de unión de las deshidrogenasas del Rojo HE-3B es mayor para las deshidrogenasas dependientes de NADP+ que para las deshidrogenasas dependientes de NAD+, y viceversa para el Azul Cibacron F3G-A. [9] Se puede utilizar para purificar las enterotoxinas A, B y C 2 de Staphylococcus aureus utilizando Procion Red HE-3B en sefarosa, eluyendo con fosfato 60 mM y 150 mM. [10]
El amarillo HA o amarillo reactivo 3 tiene una fórmula de C 21 H 17 ClN 8 O 7 S 2 y un peso molecular de 593 g/mol, conteniendo un anillo de monoclorotriazina. Sobre agarosa como matriz de soporte, se observó que purificaba la proteína de transferencia de ésteres de colesterilo. [11]
Brown MX-5BR o Reactive Brown 10 tiene una fórmula de C 40 H 19 Cl 4 CrN 12 Na 2 O 12 S 2 y un peso molecular de 1163,6 g/mol, conteniendo dos anillos de diclorotriazina. [12] Brown MX-5BR, por ejemplo, puede ser utilizado para purificar la lisozima, fosfinotricina acetiltransferasa. [13] También ha demostrado que puede eluir la triptofanil-ARNt sintetasa utilizando Trp como eluyente, sin embargo, la triptofanil-ARNt y la tirosil-ARNt sintetasa son las únicas t-ARN que pueden eluirse utilizando Brown MX-5BR. [14]