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Evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial

Esquema de las fases principales de un experimento SELEX. Este ciclo puede repetirse hasta 20 veces durante un período de varias semanas, aunque algunos métodos requieren muchos menos ciclos.
Estructura de un aptámero de ARN específico para la biotina . La superficie y la estructura del aptámero se muestran en amarillo. La biotina (esferas) encaja perfectamente en una cavidad de la superficie del ARN.

La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial ( SELEX ), también conocida como selección in vitro o evolución in vitro , es una técnica de química combinatoria en biología molecular para producir oligonucleótidos de ADN o ARN monocatenario que se unen específicamente a un ligando o ligandos objetivo. Estos ADN o ARN monocatenarios se conocen comúnmente como aptámeros . [1] [2] [3] Aunque SELEX ha surgido como el nombre más comúnmente utilizado para el procedimiento, algunos investigadores se han referido a él como SAAB (sitio de unión seleccionado y amplificado) y CASTing (amplificación cíclica y selección de objetivos) [4] [5] SELEX se introdujo por primera vez en 1990. En 2015, se publicó un número especial en el Journal of Molecular Evolution en honor al cuarto de siglo del descubrimiento de SELEX. [6]

El proceso comienza con la síntesis de una biblioteca de oligonucleótidos muy grande, que consiste en secuencias generadas aleatoriamente de longitud fija flanqueadas por extremos constantes 5' y 3' . Los extremos constantes sirven como cebadores , mientras que se espera que una pequeña cantidad de regiones aleatorias se unan específicamente al objetivo elegido. Para una región generada aleatoriamente de longitud n , la cantidad de secuencias posibles en la biblioteca utilizando ADN o ARN convencional es 4 n ( n posiciones con cuatro posibilidades (A, T, C, G) en cada posición). Las secuencias en la biblioteca se exponen al ligando objetivo, que puede ser una proteína o un compuesto orgánico pequeño , y las que no se unen al objetivo se eliminan, generalmente por cromatografía de afinidad o captura del objetivo en perlas paramagnéticas. [7] Las secuencias unidas se eluyen y amplifican por PCR [2] [3] para prepararlas para rondas posteriores de selección en las que se puede aumentar la rigurosidad de las condiciones de elución para identificar las secuencias de unión más ajustadas. [2] Una precaución a tener en cuenta en este método es que la selección de entidades con una afinidad de unión extremadamente alta, subnanomolar, de hecho puede no mejorar la especificidad para la molécula objetivo. [ 8] La unión fuera del objetivo a moléculas relacionadas podría tener efectos clínicos significativos.

SELEX se ha utilizado para desarrollar una serie de aptámeros que se unen a objetivos interesantes tanto para fines clínicos como de investigación. [9] Se han incorporado nucleótidos con azúcares y bases modificados químicamente en las reacciones de SELEX para aumentar la diversidad química en cada base, expandiendo las posibilidades de unión específica y sensible, o aumentando la estabilidad en suero o in vivo . [9] [10]

Procedimiento

Los aptámeros han surgido como una categoría novedosa en el campo de los biorreceptores debido a sus amplias aplicaciones, que van desde la biodetección hasta la terapéutica. Se han descrito diversas variaciones de su proceso de selección, denominado SELEX, que pueden producir secuencias con las propiedades deseadas necesarias para su uso final. [11]

Generación de una biblioteca de oligonucleótidos monocatenarios

El primer paso de SELEX implica la síntesis de secuencias de oligonucleótidos total o parcialmente aleatorizadas de cierta longitud flanqueadas por regiones definidas que permiten la amplificación por PCR de esas regiones aleatorizadas y, en el caso de ARN SELEX, la transcripción in vitro de la secuencia aleatorizada. [2] [3] [12] Mientras que Ellington y Szostak demostraron que la síntesis química es capaz de generar ~10 15 secuencias únicas para bibliotecas de oligonucleótidos en su artículo de 1990 sobre selección in vitro, [3] encontraron que la amplificación de estos oligonucleótidos sintetizados condujo a una pérdida significativa de la diversidad del pool debido al sesgo de PCR y defectos en los fragmentos sintetizados. [3] El pool de oligonucleótidos se amplifica y se añade una cantidad suficiente de la biblioteca inicial a la reacción para que haya numerosas copias de cada secuencia individual para minimizar la pérdida de posibles secuencias de unión debido a eventos estocásticos. [3] Antes de introducir la biblioteca en el objetivo para la incubación y la retención selectiva, la biblioteca de secuencias debe convertirse en oligonucleótidos monocatenarios para lograr conformaciones estructurales con propiedades de unión al objetivo. [2] [3]

Incubación de objetivos

Inmediatamente antes de la introducción del objetivo, la biblioteca de oligonucleótidos monocatenarios a menudo se calienta y se enfría lentamente para renaturalizar los oligonucleótidos en estructuras secundarias y terciarias termodinámicamente estables. [3] [7] Una vez preparada, la biblioteca aleatorizada se incuba con el objetivo inmovilizado para permitir la unión oligonucleótido-objetivo. Hay varias consideraciones para este paso de incubación del objetivo, incluido el método de inmovilización del objetivo y las estrategias para la posterior separación de oligonucleótidos no unidos, el tiempo y la temperatura de incubación, las condiciones del tampón de incubación y las concentraciones de objetivo versus oligonucleótido. Los ejemplos de métodos de inmovilización del objetivo incluyen columnas de cromatografía de afinidad , [3] filtros de ensayo de unión de nitrocelulosa , [2] y perlas paramagnéticas. [7] Recientemente, se han desarrollado reacciones SELEX donde el objetivo son células completas, que se expanden cerca de la confluencia completa y se incuban con la biblioteca de oligonucleótidos en placas de cultivo. [13] Las condiciones del tampón de incubación se modifican en función del objetivo previsto y la función deseada del aptámero seleccionado. Por ejemplo, en el caso de pequeñas moléculas y proteínas cargadas negativamente, se utilizan tampones con alto contenido de sal para la detección de carga para permitir que los nucleótidos se acerquen al objetivo y aumenten la posibilidad de un evento de unión específico. [3] Alternativamente, si la función deseada del aptámero es la unión a proteínas in vivo o a células enteras para una posible aplicación terapéutica o diagnóstica, es más probable que las condiciones del tampón de incubación similares a las concentraciones de sal plasmática in vivo y las temperaturas homeostáticas generen aptámeros que puedan unirse in vivo. Otra consideración en las condiciones del tampón de incubación son los competidores no específicos. Si existe una alta probabilidad de retención de oligonucleótidos no específicos en las condiciones de reacción, se pueden utilizar competidores no específicos, que son moléculas pequeñas o polímeros distintos de la biblioteca SELEX que tienen propiedades físicas similares a los oligonucleótidos de la biblioteca, para ocupar estos sitios de unión no específicos. [13] Variar la concentración relativa del objetivo y los oligonucleótidos también puede afectar las propiedades de los aptámeros seleccionados. Si una buena afinidad de unión para el aptámero seleccionado no es una preocupación, entonces se puede utilizar un exceso de objetivo para aumentar la probabilidad de que al menos algunas secuencias se unan durante la incubación y se retengan. Sin embargo, esto no proporciona presión selectiva para una alta afinidad de unión , lo que requiere que la biblioteca de oligonucleótidos sea excesiva para que haya competencia entre secuencias únicas por los sitios de unión específicos disponibles. [2]

Elución y amplificación de la secuencia de unión

Una vez que la biblioteca de oligonucleótidos se ha incubado con el objetivo durante el tiempo suficiente, los oligonucleótidos no unidos se eliminan del objetivo inmovilizado, a menudo utilizando el tampón de incubación para que se conserven los oligonucleótidos específicamente unidos. [3] Con las secuencias no unidas eliminadas, las secuencias específicamente unidas se eluyen creando condiciones desnaturalizantes que promueven el desdoblamiento del oligonucleótido o la pérdida de la conformación de unión, incluido el flujo en agua desionizada, [3] utilizando soluciones desnaturalizantes que contienen urea y EDTA, [13] [14] o aplicando calor alto y fuerza física. [7] Tras la elución de las secuencias unidas, los oligonucleótidos retenidos se transcriben de forma inversa a ADN en el caso de ARN o selecciones de bases modificadas, [2] [3] [13] o simplemente se recogen para la amplificación en el caso de ADN SELEX. [15] Estas plantillas de ADN de secuencias eluidas se amplifican luego mediante PCR y se convierten en ADN monocatenario, ARN u oligonucleótidos de base modificados, que se utilizan como entrada inicial para la siguiente ronda de selección. [2] [3]

Obtención de ssDNA

Uno de los pasos más críticos en el procedimiento SELEX es la obtención de ADN monocatenario (ssDNA) después del paso de amplificación por PCR. Esto servirá como entrada para el siguiente ciclo, por lo que es de vital importancia que todo el ADN sea monocatenario y se pierda lo menos posible. Debido a la relativa simplicidad, uno de los métodos más utilizados es el uso de cebadores inversos biotinilados en el paso de amplificación, después de lo cual las hebras complementarias se pueden unir a una resina seguido de la elución de la otra hebra con lejía. Otro método es la PCR asimétrica, donde el paso de amplificación se realiza con un exceso de cebador directo y muy poco cebador inverso, lo que conduce a la producción de más de la hebra deseada. Un inconveniente de este método es que el producto debe purificarse del ADN bicatenario (dsDNA) y otro material sobrante de la reacción de PCR. La degradación enzimática de la hebra no deseada se puede realizar marcando esta hebra con un cebador con sonda de fosfato, ya que es reconocido por enzimas como la exonucleasa Lambda . Estas enzimas luego degradan selectivamente la cadena marcada con fosfato dejando la cadena complementaria intacta. Todos estos métodos recuperan aproximadamente del 50 al 70% del ADN. Para una comparación detallada, consulte el artículo de Svobodová et al. donde estos y otros métodos se comparan experimentalmente. [16] En SELEX clásico, el proceso de generación aleatoria de bibliotecas monocatenarias, incubación del objetivo y elución y amplificación de la secuencia de unión descrito anteriormente se repiten hasta que la gran mayoría del grupo retenido consiste en secuencias de unión al objetivo, [2] [3] aunque existen modificaciones y adiciones al procedimiento que se utilizan a menudo, que se analizan a continuación.

Selección negativa o contraria

Para aumentar la especificidad de los aptámeros seleccionados mediante un procedimiento SELEX determinado, se puede añadir un paso de selección negativa, o contraselección, antes o inmediatamente después de la incubación del objetivo. Para eliminar secuencias con afinidad por los componentes de la matriz de inmovilización del objetivo del conjunto, se puede utilizar la selección negativa, en la que la biblioteca se incuba con componentes de la matriz de inmovilización del objetivo y se conservan las secuencias no unidas. [14] [17] [15] La selección negativa también se puede utilizar para eliminar secuencias que se unen a moléculas o células similares al objetivo incubando la biblioteca de oligonucleótidos con análogos de moléculas pequeñas del objetivo, tipos de células no deseados o proteínas no objetivo y conservando las secuencias no unidas. [13] [15] [18]

Seguimiento de la progresión de la selección

Para seguir el progreso de una reacción SELEX, el número de moléculas unidas al objetivo, que es equivalente al número de oligonucleótidos eluidos, se puede comparar con la entrada total estimada de oligonucleótidos después de la elución en cada ronda. [3] [19] El número de oligonucleótidos eluidos se puede estimar a través de estimaciones de concentración de elución mediante absorbancia de longitud de onda de 260 nm [19] o etiquetado fluorescente de oligonucleótidos. [7] A medida que la reacción SELEX se acerca a su finalización, la fracción de la biblioteca de oligonucleótidos que se une al objetivo se acerca al 100%, de modo que el número de moléculas eluidas se acerca a la estimación de entrada total de oligonucleótidos, pero puede converger en un número menor. [3]

Advertencias y consideraciones

Algunas reacciones SELEX pueden generar sondas que dependen de las regiones de unión de cebadores para la formación de estructuras secundarias. [7] Existen aplicaciones de aptámeros para las que es deseable una secuencia corta y, por lo tanto, el truncamiento del cebador. [20] Un avance en el método original permite que una biblioteca de ARN omita las regiones de cebadores constantes, que pueden ser difíciles de eliminar después del proceso de selección porque estabilizan las estructuras secundarias que son inestables cuando se forman solo por la región aleatoria. [21]

Nucleótidos modificados químicamente

Recientemente, SELEX se ha ampliado para incluir el uso de nucleótidos modificados químicamente. Estos oligonucleótidos modificados químicamente ofrecen muchas ventajas potenciales para aptámeros seleccionados, entre ellas, mayor estabilidad y resistencia a las nucleasas, unión mejorada para objetivos seleccionados, propiedades físicas expandidas (como mayor hidrofobicidad) y conformaciones estructurales más diversas. [9] [10] [22]

El alfabeto genético, y por lo tanto los posibles aptámeros, también se expande utilizando pares de bases no naturales [23] [24] el uso de estos pares de bases no naturales se aplicó a SELEX y se generaron aptámeros de ADN de alta afinidad. [25]

Variantes de SELEX y métodos alternativos de selección de aptámeros

FRELEX fue desarrollado en 2016 por NeoVentures Biotechnology Inc para permitir la selección de aptámeros sin inmovilizar el objetivo o la biblioteca de oligonucleótidos. [26] La inmovilización es un componente necesario de SELEX; ​​sin embargo, tiene el potencial de inhibir epítopos clave y, por lo tanto, debilitar la probabilidad de unión exitosa, particularmente cuando se trabaja con moléculas pequeñas. [27] [28] FRELEX sigue una metodología general similar a SELEX; ​​sin embargo, en lugar de inmovilizar el objetivo, el investigador introduce una serie de oligonucleótidos aleatorios y bloqueadores en un campo de inmovilización antes de la introducción en el objetivo. [26] Esto permite al investigador apuntar mejor a las moléculas pequeñas que pueden perderse durante la partición. [26] También se puede utilizar en algunas circunstancias para seleccionar una biblioteca de aptámeros sin conocer el objetivo. [29]

La mayoría de los métodos de selección de aptámeros modernos se esfuerzan por mejorar el método convencional de búsqueda de aptámeros SELEX. [30] A pesar de la publicación de varios métodos destinados a aumentar la afinidad y especificidad de los aptámeros, [31] [32] [33] los enfoques experimentales enfrentan limitaciones en el número y variedad de secuencias que se pueden examinar y seleccionar. La capacidad de la biblioteca para los experimentos SELEX está prácticamente limitada a 10 15 candidatos, mientras que, suponiendo que hay un repertorio de 4 monoméricos a partir del cual se pueden crear grupos, hay ~1,6 × 10 60 secuencias únicas en el espacio de secuencias limitado a una matriz de 100 residuos, lo que claramente está más allá de las capacidades experimentales. [34] La biblioteca de oligonucleótidos debe ser extremadamente diversa y no contener estructuras lineales, incapaces de proporcionar una disposición espacial estable y de doble cadena; debido a estas limitaciones, las bibliotecas de oligonucleótidos pueden cubrir la diversidad de solo ~10 6 secuencias. [35] Esto significa que los aptámeros existentes pueden no cubrir por completo la diversidad de moléculas objetivo o pueden no tener propiedades óptimas debido a las limitaciones del método subyacente. Para obtener los mejores aptámeros posibles, se debe maximizar la eficacia del proceso de descubrimiento y de la biblioteca en sí.

La predicción de la estructura secundaria del ARN y el ADN mediante algoritmos de programación dinámica como RNAfold ( ViennaRNA ) [36] y mediante modelos de aprendizaje automático como SPOT-RNA, [37] MXfold2 [38] brinda la oportunidad de evaluar la capacidad de las secuencias en la biblioteca primaria para plegarse en estructuras complejas, lo que permite la selección solo de las secuencias más prometedoras de todo el grupo. Sin embargo, estos algoritmos tienen un bajo rendimiento, lo que los hace poco adecuados para esta tarea. Por esta razón, se han desarrollado algoritmos como Ufold de la Universidad de California [39] y AliNA de Xelari Inc. [40] , que demuestran un aumento significativo en la velocidad computacional debido a su arquitectura más rápida, y se pueden aplicar para el análisis preliminar in silico de estas bibliotecas.

Objetivos previos

La técnica se ha utilizado para desarrollar aptámeros de afinidad de unión extremadamente alta a una variedad de ligandos objetivo, incluyendo moléculas pequeñas como ATP [41] y adenosina [12] [42] y proteínas como priones [43] y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). [44] Además, SELEX se ha utilizado para seleccionar aptámeros de alta afinidad para objetivos complejos como células tumorales, [45] [46] exosomas tumorales, [47] [48] o tejido tumoral. [49] Los usos clínicos de la técnica son sugeridos por aptámeros que se unen a marcadores tumorales , [50] fluoróforos relacionados con GFP , [51] y un aptámero de unión a VEGF con nombre comercial Macugen ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento de la degeneración macular . [44] [52] Además, SELEX se ha utilizado para obtener ADN catalítico altamente específico o ADNzimas. Se han descrito varias ADNzimas específicas de metales, entre ellas la ADNzima GR-5 (específica del plomo), [53] las ADNzimas CA1-3 (específicas del cobre), [54] la ADNzima 39E (específica del uranilo) [55] y la ADNzima NaA43 (específica del sodio). [56]

Estos aptámeros desarrollados han tenido diversas aplicaciones en terapias para la degeneración macular [52] y varias aplicaciones de investigación, incluidos biosensores , [20] etiquetado fluorescente de proteínas [57] y células, [58] e inhibición selectiva de enzimas. [59]

Véase también

Referencias

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