En bioquímica o química , el ensayo de unión por filtración es una forma sencilla de estudiar rápidamente muchas muestras. Una de las formas de conocer la interacción entre dos moléculas es determinar la constante de unión , que es un número que describe la proporción de moléculas unidas y no unidas. Esta información revela la afinidad entre las dos moléculas y permite predecir la cantidad unida dadas las condiciones iniciales.
Para medir una constante de enlace, se debe encontrar una forma de medir la cantidad de complejo formado en un rango de concentraciones iniciales. Esto se puede lograr "marcando" una de las especies con una etiqueta fluorescente o, en este caso, radiactiva . El ADN se "marca" mediante la adición de fosfato radiactivo derivado del trifosfato de adenosina .
Un ensayo de unión de filtros mide las afinidades entre dos moléculas (a menudo, proteína y ADN) utilizando un filtro . El filtro está construido de papel de nitrocelulosa , que tiene carga negativa. Dado que la mayoría de las proteínas tienen una carga neta positiva, el papel de nitrocelulosa es ideal para inmovilizar proteínas. El ADN tiene carga negativa debido a la estructura de fosfato y no se "adherirá" a la nitrocelulosa por sí solo; sin embargo, cualquier ADN que haya sido unido por proteína se adherirá. La cantidad exacta de ADN "adherido" a la nitrocelulosa se cuantifica midiendo la cantidad de radiactividad en el filtro utilizando un contador de centelleo .
Las proteínas y el ADN se mezclan en una serie de tubos de microcentrífuga en los que la cantidad de ADN se mantiene constante, pero la cantidad de proteína se aumenta de forma incremental. Se deja que estas muestras se equilibren. Después del equilibrio, se vierte un volumen igual de cada tubo sobre pequeños filtros de nitrocelulosa redondos que están dispuestos sobre una placa de vacío (una superficie plana a la que se le aplica un vacío desde abajo para succionar el líquido hacia abajo). Toda la proteína se adherirá, pero solo la proteína que se haya unido al ADN se registrará en el contador de centelleo .
Ahora, tendrá un número que describe la cantidad de ADN unido para cada concentración de proteína utilizada, esta información se puede trazar en una curva de unión para determinar la constante de unión .
Este ensayo ya no se utiliza ampliamente, pero es rápido y sencillo y puede proporcionar mucha información. Se utilizaría para un análisis relativamente detallado de una interacción proteína-ADN en particular, por ejemplo.
Mida la constante de equilibrio:
Medir la tasa de desviación:
Otra forma de medir la desviación estándar: