La activación CRISPR (CRISPRa) es un tipo de herramienta CRISPR que utiliza versiones modificadas de efectores CRISPR sin actividad endonucleasa , con activadores transcripcionales agregados en dCas9 o los ARN guía (gRNA) . [1]
Al igual que en el caso de la interferencia CRISPR , el efector CRISPR es guiado hacia el objetivo mediante un ARN guía complementario. Sin embargo, los sistemas de activación CRISPR se fusionan con activadores transcripcionales para aumentar la expresión de genes de interés. Dichos sistemas se pueden utilizar para muchos fines, incluidos, entre otros, análisis genéticos y sobreexpresión de proteínas de interés. El efector más utilizado se basa en Cas9 (de sistemas de tipo II), pero también se han utilizado otros efectores como Cas12a (tipo V). [2]
Cas9 Endonuclease Dead, también conocida como Cas9 muerta o dCas9 , es una forma mutante de Cas9 cuya actividad endonucleasa se elimina mediante mutaciones puntuales en sus dominios de endonucleasa. De manera similar a su forma no mutada, dCas9 se usa en sistemas CRISPR junto con gRNA para apuntar a genes específicos o nucleótidos complementarios al gRNA con secuencias PAM que permiten que Cas9 se una. Cas9 normalmente tiene 2 dominios de endonucleasa llamados dominios RuvC y HNH. Las mutaciones puntuales D10A y H840A cambian 2 residuos importantes para la actividad endonucleasa que finalmente resulta en su desactivación. Aunque dCas9 carece de actividad endonucleasa, todavía es capaz de unirse a su ARN guía y a la cadena de ADN a la que se dirige porque dicha unión está controlada por otros dominios. Esto por sí solo suele ser suficiente para atenuar, si no bloquear completamente, la transcripción del gen objetivo si el ARNg posiciona dCas9 de una manera que impida que los factores transcripcionales y la ARN polimerasa accedan al ADN. Sin embargo, esta capacidad de unirse al ADN también se puede aprovechar para la activación, ya que dCas9 tiene regiones modificables, típicamente los extremos N y C de la proteína, que se pueden usar para unir activadores transcripcionales. [3]
Un pequeño ARN guía ( sgRNA ), o gRNA, es un ARN con alrededor de 20 nucleótidos que se utiliza para dirigir Cas9 o dCas9 a sus objetivos. Los gRNA contienen dos regiones principales de importancia para los sistemas CRISPR: las regiones andamio y espaciadora. La región espaciadora tiene nucleótidos que son complementarios a los que se encuentran en los genes diana, a menudo en la región promotora . La región de andamio es responsable de la formación de un complejo con (d)Cas9. Juntos, se unen a (d)Cas9 y lo dirigen al gen o genes de interés. Dado que la región espaciadora de un ARNg se puede modificar para cualquier secuencia potencial, dan a los sistemas CRISPR mucha más flexibilidad, ya que cualquier gen y nucleótido con una secuencia complementaria a la región espaciadora puede convertirse en posibles objetivos. [3]
Ver: Activador Transcripcional , Factor de Transcripción
Los activadores transcripcionales son dominios proteicos o proteínas completas unidas a dCas9 o sgRNA que ayudan en el reclutamiento de cofactores importantes, así como de la ARN polimerasa para la transcripción de los genes a los que se dirige el sistema. Para que se produzca una proteína a partir del gen que la codifica, la ARN polimerasa debe producir ARN a partir del molde de ADN del gen durante un proceso llamado transcripción. Los activadores transcripcionales tienen un dominio de unión al ADN y un dominio para la activación de la transcripción. El dominio de activación puede reclutar factores de transcripción generales o ARN polimerasa a la secuencia del gen. Los dominios de activación también pueden funcionar facilitando la transcripción mediante ARN polimerasas detenidas y, en eucariotas, pueden actuar para mover nucleosomas en el ADN o modificar histonas para aumentar la expresión génica. [4] Estos activadores se pueden introducir en el sistema mediante la unión a dCas9 o al sgRNA. Algunos investigadores han observado que el grado de regulación positiva transcripcional se puede modular mediante el uso de múltiples sitios para la unión del activador en un experimento y mediante el uso de diferentes variaciones y combinaciones de activadores a la vez en un experimento o muestra determinados. [5] [6] [7]
Se requiere un sistema de expresión para la introducción de los ARNg y las proteínas (d)Cas9 en las células de interés. Las opciones empleadas normalmente incluyen, entre otras, plásmidos y vectores virales tales como el vector de virus adenoasociado (AAV) o el vector de lentivirus .
El activador dCas9 VP64-p65-Rta, o VPR, se creó modificando un activador de dCas9 existente, en el que un activador transcripcional Vp64 se une al extremo C de dCas9. [1] En la proteína dCas9-VPR, los factores de transcripción p65 y Rta se agregan al extremo C de dCas9-Vp64. Por lo tanto, los tres factores de transcripción están dirigidos al mismo gen. El uso de tres factores de transcripción, a diferencia de únicamente Vp64, da como resultado una mayor expresión de genes específicos. Cuando dCas9 se dirigió a diferentes genes, todos mostraron una expresión significativamente mayor con dCas9-VPR que con dCas9-VP64. También se ha demostrado que dCas9-VPR se puede utilizar para aumentar la expresión de múltiples genes dentro de la misma célula colocando múltiples sgRNA en la misma célula. [8] dCas9-VPR se ha utilizado para activar los genes de neurogenina 2 (enlace) y diferenciación neurogénica 1 (enlace), lo que da como resultado la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en neuronas inducidas . [8] Un estudio que comparó los activadores de dCas9 encontró que los activadores VPR, SAM y Suntag funcionaron mejor con dCas9 para aumentar la expresión genética en una variedad de tipos de células humanas , de ratón y de mosca de la fruta . [9]
Para superar la limitación del sistema de activación del gen dCas9-VP64, se desarrolló el sistema dCas9-SAM para incorporar múltiples factores transcripcionales. Utilizando las proteínas MS2 , p65 y HSF1 , el sistema dCas9-SAM recluta varios factores transcripcionales que trabajan de forma sinérgica para activar el gen de interés.
Para ensamblar diferentes activadores transcripcionales, el sistema dCas9-SAM utiliza un ARN guía único modificado (sgRNA) que tiene sitios de unión para la proteína MS2. Los aptámeros en horquilla se unen al tetra loop y al tallo loop 2 del sgRNA para convertirse en sitios de unión para las proteínas de cubierta del bacteriófago MS2 dimerizadas. A medida que las horquillas quedan expuestas fuera del complejo dCas9-sgRNA, otros factores transcripcionales pueden unirse a la proteína MS2 sin alterar el complejo dCas9-sgRNA. Por tanto, la proteína MS2 está diseñada para incluir las proteínas p65 y HSF1. La proteína de fusión MS2-p65-HSF1 interactúa con dCas9-VP64 para reclutar más factores transcripcionales en el promotor de los genes diana.
Empleando el sistema dCas-SAM, Zhang et al. (2015) reactivaron con éxito el gen latente del VIH para sobreexpresar proteínas virales de las células huésped del VIH. [10] Pudieron sobreexpresar proteínas virales sustancialmente para desencadenar la apoptosis de las células latentes del VIH-1 debido a la toxicidad de las proteínas virales. En otro experimento del sistema dCas-SAM, Konermann et al. (2015) encontraron genes en células de melanoma que dan resistencia a un inhibidor de BRAF mediante la activación de genes candidatos a través del sistema dCas. [7] Por lo tanto, el sistema dCas9-SAM se puede emplear aún más para activar genes latentes, desarrollar terapias genéticas y descubrir nuevos genes.
El sistema activador SunTag utiliza la proteína dCas9, que está modificada para vincularse con SunTag. El SunTag es una matriz de polipéptidos repetitivos que puede reclutar múltiples copias de anticuerpos . Al unir factores transcripcionales a los anticuerpos, el complejo activador SunTag dCas9 amplifica su reclutamiento de factores transcripcionales. Para guiar la proteína dCas9 hacia su gen objetivo, el sistema dCas9 SunTag utiliza sgRNA .
A Tanenbaum et al. (2014) se les atribuye la creación del sistema dCas9 SunTag. [11] Para los anticuerpos , emplearon anticuerpos GCN4 que estaban unidos al factor transcripcional VP64. Para transportar los anticuerpos a los núcleos de las células, colocaron una etiqueta NLS . Para confirmar la localización nuclear de los anticuerpos, se utilizó sfGFP con fines de visualización. Por lo tanto, la proteína GCN4-sfGFP-NLS-VP64 se desarrolló para interactuar con el sistema dCas SunTag. Los anticuerpos se unieron con éxito a los polipéptidos SunTag y activaron el gen CXCR4 objetivo en las líneas celulares K562. [11] En comparación con el complejo de activación dCas9-VP64, pudieron aumentar la expresión del gen CXCR4 entre 5 y 25 veces más en las líneas celulares K562. No solo hubo una mayor sobreexpresión de la proteína CXCR4, sino que también las proteínas CXCR4 estuvieron activas para viajar más en el ensayo de migración Transwell. Por tanto, el sistema dCas9-SunTag se puede utilizar para activar genes que están presentes de forma latente, como los genes de virus.
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El sistema de activación dCas9 permite expresar uno o varios genes deseados en la misma célula. Es posible estudiar genes implicados en un determinado proceso utilizando una pantalla genómica amplia que implica la activación de la expresión de genes. Examinar qué sgRNA producen un fenotipo sugiere qué genes están involucrados en una vía específica. El sistema de activación dCas9 se puede utilizar para controlar exactamente qué células se activan y en qué momento se produce la activación. Se han creado construcciones de dCas9 que activan una proteína de fusión activadora de dCas9 en presencia de luz o productos químicos. Las células también se pueden reprogramar o diferenciar de un tipo de célula a otro aumentando la expresión de ciertos genes importantes para la formación o el mantenimiento de un tipo de célula. [12]
Un grupo de investigación utilizó un sistema en el que dCas9 se fusionaba con un dominio particular, C1B1. Cuando se ilumina la célula con luz azul, el dominio del criptocromo 2 (Cry2) se une a C1B1. El dominio Cry2 está fusionado con un activador transcripcional , por lo que la luz azul dirige el activador al lugar donde se une dCas9. El uso de la luz permite un gran control sobre cuándo se activa el gen objetivo. Al eliminar la luz de la célula, solo queda dCas9 en el gen objetivo, por lo que la expresión no aumenta. De esta forma, el sistema es reversible. [13] Se desarrolló un sistema similar utilizando control químico. En este sistema, dCas9 recluta una proteína de fusión MS2 que contiene el dominio FKBP. En presencia del químico RAP, un dominio FRB fusionado a un complejo modificador de cromatina se une a FKBP. Siempre que se agrega RAP a las células, se puede dirigir un complejo modificador de cromatina específico al gen. Eso permite a los científicos examinar cómo las modificaciones específicas de la cromatina afectan la expresión de un gen. [14] El sistema dCAs9-VPR se utiliza como activador dirigiéndolo al promotor de un gen aguas arriba de la región codificante. Un estudio utilizó varios sgRNA para apuntar a diferentes porciones del gen y descubrió que el activador dCas9-VPR puede actuar como activador o represor, dependiendo de la ubicación a la que se une. En una célula, los sgRNA que se dirigen al promotor podrían permitir que dCas9-VPR aumente la expresión, mientras que los sgRNA que se dirigen a la región codificante del gen dan como resultado una disminución de la expresión de dCas9-VPR. [15]
La versatilidad de los sgRNA permite a los activadores de dCas9 aumentar la expresión de cualquier gen dentro del genoma de un organismo. Esto podría usarse para aumentar la expresión de un gen codificante de proteína o un ARN transcrito. Un artículo demostró que la activación de todo el genoma podría usarse para determinar qué proteínas están involucradas en la resistencia mediada a un fármaco específico. [7] Otro artículo utilizó la activación de todo el genoma de ARN largos no codificantes y observó que el aumento de la expresión de ciertos ARN largos no codificantes confería resistencia al fármaco vemurafenib. [16] En ambos casos, las células que sobreviven al fármaco podrían estudiarse para determinar qué sgRNA contienen. Eso permite a los investigadores determinar qué gen se activó en cada célula superviviente, lo que sugiere qué genes son importantes para la resistencia a ese fármaco.
Una fusión de dCas9 con VP64, p65 y HSF1 (factor de choque térmico 1) permitió a los investigadores apuntar a genes en Arabidopsis thaliana y aumentar la transcripción a un nivel similar al que ocurre cuando el gen mismo se inserta en el genoma de la planta. Para uno de los dos genes probados, el activador dCas9 cambia la cantidad y el tamaño de las hojas y hace que las plantas sean más capaces de soportar la sequía. Los autores concluyen que el activador dCas9 puede crear fenotipos en plantas similares a los observados cuando se inserta un transgén para sobreexpresión. [17] Los investigadores han utilizado múltiples ARN guía para dirigir el sistema de activación de dCas9 a múltiples genes en una cepa de ratón específica en la que dCas9 se puede activar en líneas celulares específicas utilizando el sistema de recombinasa Cre . Los científicos utilizaron la orientación y el aumento de la expresión de varios genes para examinar los procesos implicados en la regeneración y los carcinomas de hígado . [18]