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ARN guía

El ARN guía (gRNA) o ARN guía simple (sgRNA) es una secuencia corta de ARN que funciona como guía para la endonucleasa Cas9 u otras proteínas Cas [1] que cortan el ADN bicatenario y, por lo tanto, se pueden usar para la edición genética. [2] En bacterias y arqueas , los gRNA son parte del sistema CRISPR -Cas que sirve como defensa inmunitaria adaptativa que protege al organismo de los virus. Aquí, los gRNA cortos sirven como detectores de ADN extraño y dirigen las enzimas Cas que degradan el ácido nucleico extraño. [1] [3]

Historia

El ARN guía de edición El ARN guía fue descubierto en 1990 por B. Blum, N. Bakalara y L. Simpson a través de la hibridación Northern Blot en el ADN maxicircular mitocondrial del parásito eucariota Leishmania tarentolae. Investigaciones posteriores a mediados de la década de 2000 y los años siguientes exploraron la estructura y función del ARN guía y el sistema CRISPR-Cas. Un avance significativo ocurrió en 2012 cuando se descubrió que el ARN guía podía guiar a la endonucleasa Cas9 para introducir cortes específicos en el ADN bicatenario. Este descubrimiento condujo al Premio Nobel 2020 otorgado a Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier por sus contribuciones al desarrollo de la tecnología de edición genética CRISPR-Cas9.

ARN guía en protistas

Los protistas tripanosomátidos y otros cinetoplastos tienen un proceso de modificación postranscripcional del ARN conocido como "edición de ARN" que realiza una inserción/deleción de uridina dentro de las mitocondrias . [4] [5] Este ADN mitocondrial es circular y se divide en maxicírculos y minicírculos. Una mitocondria contiene alrededor de 50 maxicírculos que tienen regiones codificantes y no codificantes y consta de aproximadamente 20 kilobases (kb). La región codificante está altamente conservada (16-17kb) y la región no codificante varía según la especie. Los minicírculos son pequeños (alrededor de 1 kb) pero más numerosos que los maxicírculos, una mitocondria contiene varios miles de minicírculos. [6] [7] [8] Los maxicírculos pueden codificar " criptógenes " y algunos ARNg; los minicírculos pueden codificar la mayoría de los ARNg. Algunos genes de ARNm presentan sitios de inserción y deleción idénticos aunque tengan secuencias diferentes, mientras que otras secuencias de ARNm no son complementarias al ARNm preeditado. Las moléculas de maxicírculos y minicírculos se encuentran encadenadas en una red gigante de ADN dentro de la mitocondria. [9] [8] [10]

La mayoría de las transcripciones de maxicircle no pueden traducirse en proteínas debido a cambios en el marco de lectura de sus secuencias. Estos cambios se corrigen postranscripcionalmente mediante la inserción y eliminación de residuos de uridina en sitios precisos, que luego crean un marco de lectura abierto . Este marco de lectura abierto se traduce posteriormente en una proteína que es homóloga a las proteínas mitocondriales que se encuentran en otras células. [11] El proceso de inserción y eliminación de uridina está mediado por ARN guía cortos (gRNA), que codifican la información de edición a través de secuencias complementarias y permiten el apareamiento de bases entre guanina y uracilo (GU), así como entre guanina y citosina (GC), lo que facilita el proceso de edición. [12]

La función del complejo gRNA-mRNA

Los ARN guía se transcriben principalmente a partir de la región intergénica del maxicírculo de ADN y tienen secuencias complementarias al ARNm. El extremo 3' de los ARNg contiene una cola de oligonucleótidos en "U" (de 5 a 24 nucleótidos de longitud) que se encuentra en una región no codificada pero que interactúa y forma un complejo estable con regiones ricas en A y G del ARNm y el ARNg preeditados, que están estabilizados termodinámicamente por anclajes en 5' y 3'. [13] Este híbrido inicial ayuda al reconocimiento del sitio específico del ARNm que se va a editar. [14]

La edición del ARN generalmente progresa desde el extremo 3' hasta el 5' del ARNm. El proceso de edición inicial comienza cuando un ARNg forma un dúplex de ARN con una secuencia de ARNm complementaria ubicada justo aguas abajo del sitio de edición. Este emparejamiento recluta una serie de complejos de ribonucleoproteína que dirigen la escisión de la primera base desapareada adyacente al anclaje ARNg-ARNm. A continuación, la uridiltransferasa inserta una "U" en el extremo 3' y la ARN ligasa une los dos extremos cortados. El proceso se repite en el siguiente sitio de edición aguas arriba de una manera similar. Un solo ARNg generalmente codifica la información para varios sitios de edición (un "bloque" de edición), cuya edición produce un dúplex ARNg/ARNm completo. Este proceso de edición secuencial se conoce como el modelo de cascada enzimática. [14] [12] [15]

En el caso de los ARNm "paneditados", [16] el dúplex se desenrolla y otro ARNg forma un dúplex con la secuencia de ARNm editada, iniciando otra ronda de edición. Estos ARNg superpuestos forman un "dominio" de edición. Algunos genes contienen múltiples dominios de edición. [17] El grado de edición de un gen en particular varía entre las especies de tripanosomátidos. La variación consiste en la pérdida de edición en el lado 3', probablemente debido a la pérdida de clases de secuencias de minicírculos que codifican ARNg específicos. Se ha propuesto un modelo de retroposición [18] para explicar la pérdida parcial, y en algunos casos, completa, de la edición a través de la evolución. Aunque la pérdida de edición es típicamente letal, tales pérdidas se han observado en cepas de laboratorio antiguas. El mantenimiento de la edición a lo largo de la larga historia evolutiva de estos protistas antiguos sugiere la presencia de una ventaja selectiva, cuya naturaleza exacta aún es incierta. [16]

No está claro por qué los tripanosomátidos utilizan un mecanismo tan elaborado para producir ARNm. Podría haberse originado en las mitocondrias tempranas del ancestro del linaje protista kintoplasto, ya que está presente en los bodónidos que son ancestros de los tripanosomátidos, [19] y puede no estar presente en los euglenoides , que se ramificaron a partir del mismo ancestro común que los kinetoplastos.

Secuencias de ARN guía

En el protozoo Leishmania tarentolae , 12 de los 18 genes mitocondriales se editan mediante este proceso. Uno de estos genes es Cyb. El ARNm se edita dos veces seguidas. Para la primera edición, la secuencia relevante en el ARNm es la siguiente:

ARNm 5' AAAGAAAAGGCUUUAACUUCAGGUUGU 3'

El extremo 3' se utiliza para anclar el ARNm (ARNm gCyb-I en este caso) mediante el emparejamiento de bases (se utilizan algunos pares G/U). El extremo 5' no coincide exactamente y una de las tres endonucleasas específicas corta el ARNm en el sitio de desajuste.

ARNg 3' AAUAAUAAAUUUUUAAAUAUAAAUAGAAAAUUGAAGUUCAGUA 5'ARNm 5' AA AGAAA AGGC UUUAACUUCAGGUUGU 3'

Ahora el ARNm se "repara" añadiendo U en cada sitio de edición sucesivamente, dando lugar a la siguiente secuencia:

ARNg 3' AAUAAUAAAUUUUUAAAUAUAAAUAGAAAAUUGAAGUUCAGUA 5'ARNm 5' UUAUUAUUUAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGU 3'

Este gen en particular tiene dos sitios de edición de ARNg superpuestos. El extremo 5' de esta sección es el punto de anclaje 3' para otro ARNg (ARNgCyb-II). [9]

ARN guía en procariotas

CRISPR en procariotas

Los procariotas, como las bacterias y las arqueas, utilizan CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) y sus enzimas Cas asociadas, como su sistema inmunológico adaptativo. Cuando los procariotas son infectados por fagos y logran defenderse del ataque, enzimas Cas específicas cortan el ADN (o ARN) del fago e integran los fragmentos en los espacios intermedios de la secuencia CRISPR. Estos segmentos almacenados luego son reconocidos durante futuros ataques de virus, lo que permite que las enzimas Cas utilicen copias de ARN de estos segmentos, junto con sus secuencias CRISPR asociadas, como ARNm para identificar y neutralizar las secuencias extrañas. [20] [21] [22]

Estructura esquemática del complejo ternario Cas9-sgRNA-DNA

Estructura

El ARN guía se dirige a las secuencias complementarias mediante un simple apareamiento de bases Watson-Crick. [23] En el sistema CRISPR/cas de tipo II, el sgRNA dirige la enzima Cas para que se dirija a regiones específicas del genoma para la escisión dirigida del ADN. El sgRNA es una combinación diseñada artificialmente de dos moléculas de ARN: ARN CRISPR ( crRNA ) y crRNA transactivador ( tracrRNA ). El componente crRNA es responsable de la unión a la región de ADN específica del objetivo, mientras que el componente tracrRNA es responsable de la activación de la actividad de la endonucleasa Cas9. Estos dos componentes están unidos por una estructura de tetraloop corta, lo que da como resultado la formación del sgRNA. El tracrRNA consiste en pares de bases que forman una estructura de tallo-bucle, lo que permite su unión a la enzima endonucleasa . La transcripción del locus CRISPR genera crRNA, que contiene regiones espaciadoras flanqueadas por secuencias repetidas, típicamente de 18-20 pares de bases (pb) de longitud. Este crRNA guía a la endonucleasa Cas9 hacia la región complementaria del ADN, donde lo escinde y forma lo que se conoce como complejo efector. Las modificaciones en la secuencia del crRNA dentro del sgRNA pueden alterar la ubicación de unión, lo que permite una orientación precisa de diferentes regiones del ADN, lo que lo convierte en un sistema programable para la edición del genoma. [24] [25] [26]

Aplicaciones

Diseño de gRNAs

La especificidad de la segmentación de CRISPR-Cas9 está determinada por la secuencia de 20 nucleótidos (nt) en el extremo 5' del ARNm. La secuencia objetivo deseada debe preceder al motivo adyacente al protoespaciador (PAM), que es una secuencia corta de ADN, generalmente de 2 a 6 pares de bases de longitud, que sigue a la región de ADN que se desea segmentar mediante el sistema CRISPR, como CRISPR-Cas9. El PAM es necesario para que una nucleasa Cas corte y generalmente se encuentra 3 o 4 nucleótidos aguas abajo del sitio de corte. Una vez que el ARNm se empareja con el objetivo, Cas9 induce una ruptura de doble cadena aproximadamente 3 nucleótidos aguas arriba del PAM. [27] [28]

El contenido óptimo de GC de la secuencia guía debe ser superior al 50%. Un mayor contenido de GC mejora la estabilidad del dúplex ARN-ADN y reduce la hibridación fuera del objetivo. La longitud de las secuencias guía es típicamente de 20 pb, pero también pueden variar de 17 a 24 pb. Una secuencia más larga minimiza los efectos fuera del objetivo. Las secuencias guía más cortas de 17 pb corren el riesgo de apuntar a múltiples loci . [29] [30] [24]

CRISPR-Cas9

El complejo cas9, que ilustra el gRNA, PAM y la ruptura de doble cadena inducida en el ADN objetivo.

CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas)/Cas9 es una técnica utilizada para la edición de genes y la terapia génica. Cas es una enzima endonucleasa que corta el ADN en una ubicación específica dirigida por un ARN guía. Esta es una técnica específica para un objetivo que puede introducir knockouts o knock-ins genéticos dependiendo de la vía de reparación de doble cadena. La evidencia muestra que tanto in vitro como in vivo, se requiere tracrRNA para que Cas9 se una a la secuencia de ADN objetivo. El sistema CRISPR-Cas9 consta de tres etapas principales. La primera etapa implica la extensión de bases en la región del locus CRISPR mediante la adición de espaciadores de ADN extraños en la secuencia del genoma. Proteínas como cas1 y cas2 ayudan a encontrar nuevos espaciadores. La siguiente etapa implica la transcripción de CRISPR: el pre-crRNA (ARN precursor de CRISPR) se expresa mediante la transcripción de la matriz de repeticiones-espaciadores CRISPR. Tras una modificación adicional, el pre-crRNA se convierte en regiones flanqueadas por un solo espaciador que forman crRNA corto. El proceso de maduración del ARN es similar en los tipos I y III, pero diferente en el tipo II. La tercera etapa implica la unión de la proteína cas9 y su dirección para escindir el segmento de ADN. La proteína Cas9 se une a una forma combinada de crRNA y tracrRNA formando un complejo efector. Este sirve como ARN guía para la proteína cas9 que dirige su actividad endonucleasa. [31] [2] [3]

Mutagénesis del ARN

Un método importante de regulación genética es la mutagénesis del ARN, que puede introducirse mediante la edición del ARN con la ayuda del ARNg. [32] El ARN guía reemplaza la adenosina por inosina en sitios diana específicos, modificando el código genético. [33] La adenosina desaminasa actúa sobre el ARN, provocando una modificación postranscripcional alterando los codones y diferentes funciones proteicas. Los ARN guía son pequeños ARN nucleolares que, junto con las riboproteínas, realizan alteraciones intracelulares del ARN, como la ribometilación en el ARNr y la introducción de pseudouridina en el ARN prerribosómico. [34] Los ARN guía se unen a la secuencia de ARN antisentido y regulan la modificación del ARN. Se ha observado que el ARN interferente pequeño (siRNA) y el micro ARN (miRNA) se utilizan generalmente como secuencias de ARN diana, y las modificaciones son comparativamente fáciles de introducir debido a su pequeño tamaño. [35]

Véase también

Referencias

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