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Interferencia CRISPR

Represión transcripcional mediante impedimento estérico.

La interferencia CRISPR ( CRISPRi ) es una técnica de perturbación genética que permite la represión de secuencia específica de la expresión génica en células procarióticas y eucariotas . [1] Fue desarrollado por primera vez por Stanley Qi y sus colegas en los laboratorios de Wendell Lim , Adam Arkin, Jonathan Weissman y Jennifer Doudna . [2] La activación de la expresión génica específica de secuencia se refiere a la activación CRISPR (CRISPRa) .

Basada en la vía del sistema inmunológico genético bacteriano, CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas), [3] la técnica proporciona un enfoque complementario a la interferencia del ARN . Sin embargo, la diferencia entre CRISPRi y RNAi es que CRISPRi regula la expresión genética principalmente a nivel transcripcional, mientras que RNAi controla genes a nivel de ARNm.

Fondo

Muchas bacterias y la mayoría de las arqueas tienen un sistema inmunológico adaptativo que incorpora genes CRISPR RNA (crRNA) y asociados a CRISPR (cas).

La técnica de interferencia CRISPR (CRISPRi) fue reportada por primera vez por Lei S. Qi e investigadores de la Universidad de California en San Francisco a principios de 2013. [2] La tecnología utiliza una proteína Cas9 catalíticamente muerta (generalmente denominada dCas9) que carece de actividad endonucleasa. para regular genes de forma guiada por ARN. La especificidad de direccionamiento está determinada por el emparejamiento de bases complementarias de un único ARN guía (sgRNA) con el locus genómico. El sgRNA es un ARN quimérico no codificante que se puede subdividir en tres regiones: una secuencia de emparejamiento de bases de 20 nt, una horquilla de unión a dCas9 de 42 nt y un terminador de 40 nt (bacterias, [4] [5] [6] levadura, [7 ] moscas de la fruta, [8] pez cebra, [9] ratones [10] ).

Al diseñar un sgRNA sintético, solo se modifica la secuencia de emparejamiento de bases de 20 nt. También se deben considerar variables secundarias: efectos fuera del objetivo (para los cuales se requiere una simple ejecución BLAST de la secuencia de emparejamiento de bases), mantenimiento de la estructura en horquilla de unión a dCas9 y garantía de que no haya sitios de restricción presentes en el sgRNA modificado. ya que esto puede plantear un problema en los pasos de clonación posteriores. Debido a la simplicidad del diseño de sgRNA, esta tecnología es susceptible de escalamiento en todo el genoma. [11] CRISPRi se basa en la generación de Cas9 catalíticamente inactivo. Esto se logra mediante la introducción de mutaciones puntuales en los dos residuos catalíticos (D10A y H840A) del gen que codifica Cas9. [12] Al hacerlo, dCas9 no puede escindir el ADNds, pero conserva la capacidad de apuntar al ADN. Juntos, sgRNA y dCas9 constituyen un sistema mínimo para la regulación genética específica. [2]

Regulación transcripcional

Represión

CRISPRi puede reprimir estéricamente la transcripción bloqueando el inicio o el alargamiento de la transcripción. Esto se logra diseñando sgRNA complementario al promotor o a las secuencias exónicas . El nivel de represión transcripcional con una diana dentro de la secuencia codificante es específico de la cadena. Dependiendo de la naturaleza del efector CRISPR, la cadena plantilla o la cadena sin plantilla conduce a una represión más fuerte. [13] Para dCas9 (basado en un sistema CRISPR tipo 2), la represión es más fuerte cuando el ARN guía es complementario a la cadena que no es plantilla. Se ha sugerido que esto se debe a la actividad de la helicasa, que desenrolla el heterodúplex de ARN:ADN antes que la ARNpol II cuando el ARNsg es complementario a la cadena molde. A diferencia del bloqueo de elongación de la transcripción, el silenciamiento es independiente de la cadena de ADN objetivo cuando se dirige al sitio de inicio de la transcripción. En procariotas, esta inhibición estérica puede reprimir la transcripción del gen diana en casi un 99,9%; en archaea se logró más del 90% de represión; [14] en células humanas, se observó hasta un 90% de represión. [2] En las bacterias, es posible saturar el objetivo con un nivel suficientemente alto de complejo dCas9. En este caso, la fuerza de represión sólo depende de la probabilidad de que dCas9 sea expulsado al colisionar con la ARN polimerasa, que está determinada por la secuencia guía. [15] Las temperaturas más altas también están asociadas con una mayor probabilidad de eyección y, por lo tanto, una represión más débil. [15] En eucariotas, CRISPRi también puede reprimir la transcripción a través de un dominio efector. La fusión de un dominio represor con dCas9 permite reprimir aún más la transcripción mediante la inducción de heterocromatinización. Por ejemplo, el bien estudiado dominio de la caja asociada a Krüppel (KRAB) se puede fusionar con dCas9 para reprimir la transcripción del gen diana hasta en un 99% en células humanas. [dieciséis]

Mejoras en la eficiencia.

Mientras que la edición del genoma mediante la nucleasa Cas9 catalíticamente activa puede ir acompañada de alteraciones genómicas irreversibles fuera del objetivo, CRISPRi es altamente específico con efectos reversibles mínimos fuera del objetivo para dos secuencias distintas de sgRNA. [16] No obstante, se han desarrollado varios métodos para mejorar la eficiencia de la modulación transcripcional. La identificación del sitio de inicio de la transcripción de un gen objetivo y la consideración de las preferencias del sgRNA mejora la eficiencia, al igual que la presencia de cromatina accesible en el sitio objetivo. [17]

Otros metodos

Junto con otras mejoras mencionadas, factores como la distancia desde el inicio de la transcripción y el estado de la cromatina local pueden ser parámetros críticos para determinar la eficiencia de activación/represión. La optimización de la expresión, estabilidad, localización nuclear e interacción de dCas9 y sgRNA probablemente permitirá mejorar aún más la eficiencia de CRISPRi en células de mamíferos. [2]

Aplicaciones

Derribo de genes

Se ha demostrado que una porción significativa del genoma (tanto genes reporteros como endógenos) en eucariotas puede ser atacada mediante construcciones lentivirales para expresar dCas9 y sgRNA, con una eficiencia comparable a las técnicas existentes como las proteínas RNAi y TALE. [16] En conjunto o como su propio sistema, CRISPRi podría usarse para lograr las mismas aplicaciones que en RNAi.

Para las bacterias, la eliminación de genes mediante CRISPRi se ha implementado y caracterizado completamente (análisis fuera del objetivo, represión con fugas) tanto para E. coli gramnegativa [4] [6] como para B. subtilis grampositiva . [5]

No solo en bacterias sino también en arqueas (p. ej., M. acetivorans ), CRISPRi-Cas9 se utilizó con éxito para desactivar varios genes/operones relacionados con la fijación de nitrógeno. [14]

Flujo de trabajo de construcción CRISPRi

Serie alélica

La expresión génica diferencial se puede lograr modificando la eficiencia del emparejamiento de bases del sgRNA con los loci objetivo. [11] En teoría, la modulación de esta eficiencia se puede utilizar para crear una serie alélica para cualquier gen determinado, creando en esencia una colección de hipo e hipermorfosis. Estas poderosas colecciones se pueden utilizar para investigar cualquier investigación genética. Para los hipomorfos , esto permite la reducción incremental de la función genética en contraposición a la naturaleza binaria de las desactivaciones genéticas y la imprevisibilidad de las desactivaciones. Para los hipermorfos , esto contrasta con el método convencional de clonar el gen de interés bajo promotores con fuerza variable.

Imágenes de loci del genoma

La fusión de una proteína fluorescente con dCas9 permite obtener imágenes de loci genómicos en células humanas vivas. [18] En comparación con la hibridación fluorescente in situ (FISH), el método permite de forma única el seguimiento dinámico de los loci cromosómicos. Esto se ha utilizado para estudiar la arquitectura de la cromatina y la dinámica de la organización nuclear en líneas celulares de laboratorio, incluidas las células HeLa.

Células madre

La activación de factores de Yamanaka mediante CRISPRa se ha utilizado para inducir pluripotencia en células humanas y de ratón, proporcionando un método alternativo a la tecnología iPS. [19] [20] Además, se podrían utilizar pantallas de activación a gran escala para identificar proteínas que promuevan la pluripotencia inducida o, por el contrario, promuevan la diferenciación hacia un linaje celular específico. [21]

Cribado genético

La capacidad de regular positivamente la expresión genética utilizando dCas9-SunTag con un solo sgRNA también abre la puerta a análisis genéticos a gran escala, como Perturb-seq , para descubrir fenotipos que resultan de una mayor o menor expresión genética, lo que será especialmente importante para la comprensión. Los efectos de la regulación genética en el cáncer. [22] Además, se ha demostrado que los sistemas CRISPRi son transferibles mediante mecanismos de transferencia horizontal de genes , como la conjugación bacteriana y la represión específica de genes informadores en las células receptoras. CRISPRi podría servir como herramienta para el cribado genético y el control de poblaciones potencialmente bacterianas. [23]

Ventajas y limitaciones

Ventajas

  1. CRISPRi puede silenciar un gen diana de interés hasta un 99,9% de represión. [11] La fuerza de la represión también se puede ajustar cambiando la cantidad de complementariedad entre el ARN guía y el objetivo. A diferencia de los promotores inducibles, la represión parcial por CRISPRi no agrega ruido transcripcional a la expresión del objetivo. [15] Dado que el nivel de represión está codificado en una secuencia de ADN, se pueden desarrollar varios niveles de expresión en competencia e identificarlos mediante secuenciación. [24]
  2. Dado que CRISPRi se basa en el emparejamiento de bases Watson-Crick de sgRNA-DNA y un motivo NGG PAM, la selección de sitios objetivo dentro del genoma es sencilla y flexible. Se han desarrollado protocolos cuidadosamente definidos. [11]
  3. Se pueden usar múltiples sgRNA no solo para controlar múltiples genes diferentes simultáneamente (CRISPRi múltiple), sino también para mejorar la eficiencia de la regulación del mismo gen objetivo. Una estrategia popular para expresar muchos sgRNA simultáneamente es ordenar los sgRNA en una sola construcción con múltiples promotores o elementos de procesamiento. Por ejemplo, las matrices de sgRNA extralargas (ELSA) utilizan partes no repetitivas para permitir la síntesis directa de matrices de 12-sgRNA de un proveedor de síntesis de genes, pueden integrarse directamente en el genoma de E. coli sin que se produzca recombinación homóloga y pueden apuntar simultáneamente a muchos genes. para lograr fenotipos complejos. [25]
  4. Si bien los dos sistemas pueden ser complementarios, CRISPRi ofrece ventajas sobre RNAi. Como sistema exógeno, CRISPRi no compite con maquinaria endógena como la expresión o función de microARN. Además, debido a que CRISPRi actúa a nivel de ADN, se pueden apuntar a transcripciones como ARN no codificantes, microARN, transcripciones antisentido, ARN localizados en el núcleo y transcripciones de polimerasa III. Finalmente, CRISPRi posee un espacio de secuencia objetivo mucho más grande; También se pueden apuntar a promotores y, en teoría, a intrones. [dieciséis]
  5. En E. coli , la construcción de una cepa de desactivación genética es extremadamente rápida y requiere sólo una recombinación de oligonucleótidos en un solo paso . [6]

Limitaciones

  1. El requisito de una secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM) limita el número de secuencias diana potenciales. Cas9 y sus homólogos pueden utilizar diferentes secuencias PAM y, por lo tanto, teóricamente podrían utilizarse para ampliar el número de secuencias diana potenciales. [11]
  2. La especificidad de secuencia para los loci objetivo tiene solo 14 nt de largo (12 nt de sgRNA y 2 nt de PAM), que puede repetirse alrededor de 11 veces en un genoma humano. [11] La represión se correlaciona inversamente con la distancia del sitio objetivo desde el sitio de inicio de la transcripción. Las predicciones computacionales de todo el genoma o la selección de homólogos de Cas9 con un PAM más largo pueden reducir la orientación no específica.
  3. Los estados y modificaciones endógenas de la cromatina pueden impedir la unión específica de secuencia del complejo dCas9-sgRNA. [11] El nivel de represión transcripcional en células de mamíferos varía entre genes. Se necesita mucho trabajo para comprender el papel de la conformación local del ADN y la cromatina en relación con la unión y la eficiencia reguladora.
  4. CRISPRi puede influir en genes que están muy próximos al gen diana. Esto es especialmente importante cuando se dirige a genes que se superponen a otros genes (superposición sentido o antisentido) o que son impulsados ​​por un promotor bidireccional. [26]
  5. Se ha informado toxicidad específica de secuencia en eucariotas, y algunas secuencias en la región proximal de PAM causan una gran carga de aptitud física. [27] Este fenómeno, llamado "efecto de mala semilla", aún no tiene explicación, pero puede reducirse optimizando el nivel de expresión de dCas9. [28]

Referencias

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