p14ARF (también llamado supresor tumoral ARF , ARF , p14 ARF ) es un producto proteico de marco de lectura alternativo del locus CDKN2A ( es decir, locus INK4a/ARF). [ 1 ] p14ARF se induce en respuesta a una estimulación mitogénica elevada , como la señalización de crecimiento aberrante de MYC y Ras (proteína) . [2] Se acumula principalmente en el nucléolo donde forma complejos estables con NPM o Mdm2 . Estas interacciones permiten que p14ARF actúe como un supresor tumoral al inhibir la biogénesis de los ribosomas o iniciar el arresto del ciclo celular y la apoptosis dependientes de p53 , respectivamente. [3] p14ARF es una proteína atípica, en términos de su transcripción, su composición de aminoácidos y su degradación: se transcribe en un marco de lectura alternativo de una proteína diferente, es altamente básica, [1] y está poliubiquinada en el extremo N. [4 ]
Tanto p16INK4a como p14ARF están involucrados en la regulación del ciclo celular . p14ARF inhibe mdm2 , promoviendo así p53 , que promueve la activación de p21 , que luego se une e inactiva ciertos complejos ciclina - CDK , que de otra manera promoverían la transcripción de genes que llevarían a la célula a través del punto de control G 1 /S del ciclo celular. La pérdida de p14ARF por una mutación homocigótica en el gen CDKN2A ( INK4A ) conducirá a niveles elevados de mdm2 y, por lo tanto, a la pérdida de la función de p53 y del control del ciclo celular.
El equivalente en ratones es p19ARF.
La transcripción p14ARF se identificó por primera vez en humanos en 1995, [5] [6] y su producto proteico se confirmó en ratones ese mismo año. [7] Su locus genético está en el brazo corto del cromosoma 9 en humanos, y en una ubicación correspondiente en el cromosoma 4 en ratones. [1] Está ubicado cerca de los genes para las repeticiones en tándem INK4a e INK4b, que son proteínas de 16 kDa (p16 INK4a ) y 15 kDa (p15 INK4b ), respectivamente. Estas proteínas INK4 inhiben directamente las quinasas dependientes de ciclina D CDK4 y CDK6 . Hay otros genes INK4 en otros cromosomas, sin embargo, estos no están relacionados con el cáncer , por lo que no es probable que sus funciones se superpongan. Un sustrato dependiente de ciclina importante es la proteína de retinoblastoma Rb, que se fosforila en la fase de brecha 1 tardía ( fase G1 ), lo que permite la salida de G1. La proteína Rb limita la proliferación celular al bloquear la actividad de los factores de transcripción E2F , que activan la transcripción de genes necesarios para la replicación del ADN . Cuando Rb es fosforilado por ciclina D y quinasas dependientes de E durante la fase G1 del ciclo celular, Rb no puede bloquear la transcripción dependiente de E2F y la célula puede progresar a la fase de síntesis de ADN ( fase S ). [8] Por lo tanto, INK4a e INK4b actúan como supresores tumorales al restringir la proliferación a través de la inhibición de las CDK responsables de la fosforilación de Rb . [7]
Además de la proteína INK4a, la proteína no relacionada, ARF, se transcribe desde un marco de lectura alternativo en el locus INK4a/ARF. [1] El ARNm de INK4a y p14ARF consta cada uno de tres exones . Comparten los exones 2 y 3, pero hay dos transcripciones diferentes del exón 1, α y β. El exón 1β (E1β) está intercalado entre los genes de INK4a e INK4b. [1] Aunque el exón 1α (E1α) y E1β son aproximadamente iguales en términos de contenido y tamaño, el 5' AUG ( codón de inicio ) del exón 1β tiene su propio promotor y abre un marco de lectura alternativo en el exón 2, de ahí el nombre p14ARF (el exón 3 de ARF no se traduce). Debido a esto, INK4a y p14ARF tienen secuencias de aminoácidos no relacionadas a pesar de las regiones codificantes superpuestas y tienen funciones distintas. Este uso dual de secuencias codificantes no se observa comúnmente en mamíferos, lo que hace que p14ARF sea una proteína inusual. [1] Cuando se encontró la transcripción β de ARF, se pensó que probablemente no codificaría una proteína. [5] [6] En humanos, ARF se traduce en la proteína [[p14 ARF ]] de 14 kDa y 132 aminoácidos , y en ratones, se traduce en la proteína p19 Arf de 19 kDa y 169 aminoácidos . [1] El segmento proteico E1β de ARF de ratón y humano son 45% idénticos, con una identidad ARF general del 50%, en comparación con una identidad del 72% entre el segmento E1α INK4a de ratón y humano, y una identidad general del 65%. [7]
Aunque las proteínas INK4a y ARF son estructural y funcionalmente diferentes, ambas están involucradas en la progresión del ciclo celular . Juntas, su amplio papel inhibidor puede ayudar a contrarrestar las señales oncogénicas . Como se mencionó anteriormente, INK4a inhibe la proliferación al permitir indirectamente que Rb permanezca asociado con los factores de transcripción E2F . ARF está involucrado en la activación de p53 al inhibir Mdm2 (HDM2 en humanos). [8] Mdm2 se une a p53, inhibiendo su actividad transcripcional. Mdm2 también tiene actividad de ubiquitina ligasa E3 hacia p53, y promueve su exportación desde el núcleo celular al citoplasma para su degradación. Al antagonizar Mdm2, ARF permite la actividad transcripcional de p53 que conduciría a la detención del ciclo celular o apoptosis . Por lo tanto, una pérdida de ARF o p53 daría a las células una ventaja de supervivencia. [1]
La función de ARF se ha atribuido principalmente a su mecanismo Mdm2/p53. Sin embargo, ARF también inhibe la proliferación en células que carecen de p53 o p53 y Mdm2. [9] En 2004 se descubrió que una de las funciones independientes de p53 de ARF implica su unión a nucleofosmina /B23 (NPM). [9] NPM es una chaperona ribosomal ácida (proteína) involucrada en el procesamiento prerribosomal y la exportación nuclear independiente de p53, y se oligomeriza consigo misma y p14 ARF . Casi la mitad de p14 ARF se encuentra en complejos que contienen NPM con alta masa molecular (2 a 5 MDa). La expresión forzada de ARF retarda el procesamiento temprano del precursor de ARNr 47S/45S e inhibe la escisión de ARNr 32S. Esto sugiere que p14 ARF puede unirse a NPM, inhibiendo el procesamiento de ARNr. [9] Las células ARF-null tienen un área nucleolar aumentada, una biogénesis de ribosomas aumentada y un aumento correspondiente en la síntesis de proteínas . [10] Sin embargo, el mayor tamaño resultante de más ribosomas y proteínas no está asociado con una mayor proliferación, y este fenotipo ARF-null ocurre a pesar de que los niveles basales normales de Arf son generalmente bajos. La eliminación de ARF con siRNA al exón 1β da como resultado un aumento de las transcripciones de ARNr, el procesamiento de ARNr y la exportación nuclear de ribosomas. La biogénesis descontrolada de ribosomas observada cuando NPM no está unida a ARF no ocurre si NPM también está ausente. Aunque la inducción de ARF en respuesta a señales oncogénicas se considera de importancia primaria, los niveles bajos de ARF observados en células en interfase también tienen un efecto considerable en términos de mantener bajo control el crecimiento celular. Por lo tanto, la función del nivel basal de ARF en el complejo NPM/ARF parece ser monitorear la biogénesis y el crecimiento de ribosomas en estado estacionario independientemente de prevenir la proliferación. [10]
Muy comúnmente, el cáncer se asocia con una pérdida de función de INK4a, ARF, Rb o p53 . [11] Sin INK4a, Cdk4/6 puede fosforilar inapropiadamente a Rb, lo que lleva a un aumento de la transcripción dependiente de E2F . Sin ARF, Mdm2 puede inhibir inapropiadamente a p53, lo que lleva a un aumento de la supervivencia celular.
Se ha descubierto que el locus INK4a/ARF está eliminado o silenciado en muchos tipos de tumores. Por ejemplo, de los 100 carcinomas mamarios primarios, aproximadamente el 41 % tiene defectos en p14 ARF . [12] En un estudio independiente, se descubrió que el 32 % de los adenomas colorrectales (tumores no cancerosos) tenían inactivación de p14 ARF debido a la hipermetilación del promotor . Los modelos de ratón que carecen de p19 Arf , p53 y Mdm2 son más propensos al desarrollo de tumores que los ratones sin Mdm2 y p53, por sí solos. Esto sugiere que p19 Arf también tiene efectos independientes de Mdm2 y p53. [13] La investigación de esta idea condujo al reciente descubrimiento de smARF. [14]
Se ha descubierto que las deleciones homocigóticas y otras mutaciones de CDK2NA (ARF) están asociadas con el glioblastoma . [15]
Hasta hace poco, los dos efectos conocidos de ARF eran la inhibición del crecimiento por interacciones con NPM y la inducción de apoptosis por interacciones con Mdm2 . La función de ARF que implica la muerte independiente de p53 , ahora se ha atribuido a la pequeña isoforma mitocondrial de ARF, smARF. [14] Mientras que ARF de longitud completa inhibe el crecimiento celular por detención del ciclo celular o muerte apoptótica de tipo I , smARF mata las células por muerte autofágica de tipo II. Al igual que ARF, la expresión de smARF aumenta cuando hay señales de proliferación aberrantes. Cuando smARF se sobreexpresa, se localiza en la matriz mitocondrial , dañando el potencial y la estructura de la membrana mitocondrial y provocando la muerte celular autofágica. [16]
La traducción del ARF truncado, smARF, se inicia en una metionina interna (M45) del transcrito ARF en células humanas y de ratón. SmARF también se detecta en ratas, aunque no hay una metionina interna presente en el transcrito de rata. Esto sugiere que existe un mecanismo alternativo para formar smARF, lo que subraya la importancia de esta isoforma . [14] El papel de smARF es distinto al de ARF, ya que carece de la señal de localización nuclear (NLS) y no puede unirse a Mdm2 o NPM. [3] Sin embargo, en algunos tipos de células, el ARF de longitud completa también puede localizarse en las mitocondrias e inducir la muerte celular de tipo II, lo que sugiere que, además de que la autofagia es una respuesta de inanición u otra respuesta ambiental, también puede estar involucrada en la respuesta a la activación de oncogenes . [2]
La expresión de ARF está regulada por la señalización oncogénica . La estimulación mitogénica aberrante , como por MYC o Ras (proteína) , aumentará su expresión, al igual que una amplificación de p53 o Mdm2 mutados , o la pérdida de p53. [8] ARF también puede ser inducida por la expresión forzada de E2F . Aunque la expresión de E2F aumenta durante el ciclo celular , la expresión de ARF probablemente no lo sea porque la activación de un segundo factor de transcripción desconocido podría ser necesaria para prevenir una respuesta de ARF a aumentos transitorios de E2F. [11] ARF está regulada negativamente por complejos Rb-E2F [11] y por la activación amplificada de p53. [8] Las señales de crecimiento aberrantes también aumentan la expresión de smARF. [16]
ARF es una proteína altamente básica (pI>12) e hidrofóbica . [8] Su naturaleza básica se atribuye a su contenido de arginina; más del 20% de sus aminoácidos son arginina y contiene poca o ninguna lisina. Debido a estas características, es probable que ARF no esté estructurado a menos que esté unido a otros objetivos. Se informa que forma complejos con más de 25 proteínas, aunque se desconoce la importancia de cada una de estas interacciones. [1] Una de estas interacciones da como resultado una actividad sumoilante, lo que sugiere que ARF puede modificar las proteínas a las que se une. La proteína SUMO es un pequeño modificador similar a la ubiquitina , que se agrega a los grupos ε-amino de la lisis. Este proceso implica una cascada de tres enzimas similar a la forma en que ocurre la ubiquitilación . E1 es una enzima activadora, E2 es una enzima de conjugación y E3 es una ligasa. ARF se asocia con UBC9, el único SUMO E2 conocido, lo que sugiere que ARF facilita la conjugación de SUMO. Se desconoce la importancia de esta función, ya que la sumoilación está involucrada en diferentes funciones, como el tráfico de proteínas, la interferencia de la ubiquitinación y los cambios en la expresión genética. [1]
La vida media de ARF es de aproximadamente 6 horas, [4] mientras que la vida media de smARF es menor a 1 hora. [3] Ambas isoformas se degradan en el proteasoma . [1] [4] ARF es el objetivo del proteasoma por ubiquitinación del extremo N. [4] Las proteínas generalmente se ubiquinan en residuos de lisina . Sin embargo, p14 ARF humano no contiene ninguna lisina, y p19 Arf de ratón solo contiene una lisina. Si la lisina de ratón se reemplaza con arginina, no hay efecto en su degradación, lo que sugiere que también se ubiquina en el extremo N. Esto se suma a la singularidad de las proteínas ARF, porque la mayoría de las proteínas eucariotas se acetilan en el extremo N , lo que evita la ubiquitinación en esta ubicación. Los residuos penúltimos afectan la eficiencia de la acetilación, ya que la acetilación es promovida por residuos ácidos e inhibida por residuos básicos. Las secuencias de aminoácidos N-terminales de p19 Arf (Met-Gly-Arg) y p14 ARF (Met-Val-Arg) serían procesadas por la metionina aminopeptidasa pero no serían acetiladas, permitiendo que la ubiquinación proceda. La secuencia de smARF, sin embargo, predice que la metionina iniciadora no sería escindida por la metionina aminopeptidasa y probablemente sería acetilada, y por lo tanto es degradada por el proteasoma sin ubiquinación. [1]
El ARF nucleolar de longitud completa parece ser estabilizado por NPM. El complejo NPM-ARF no bloquea el extremo N de ARF pero probablemente protege a ARF de ser accedido por la maquinaria de degradación. [4] La proteína de matriz mitocondrial p32 estabiliza smARF. [16] Esta proteína se une a varias proteínas celulares y virales, pero su función exacta es desconocida. La eliminación de p32 disminuye drásticamente los niveles de smARF al aumentar su recambio. Los niveles de p19 Arf no se ven afectados por la eliminación de p32, y por lo tanto p32 estabiliza específicamente smARF, posiblemente al protegerlo del proteasoma o de las proteasas mitocondriales . [16]
Zhang, Y., Y. Xiong y WG Yarbrough. ARF promueve la degradación de MDM2 y estabiliza p53: la eliminación del locus ARF-INK4a altera las vías de supresión tumoral Rb y p53. Cell 1998, 92(6):725-34.