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Evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial.

Un esquema de las fases principales de un experimento SELEX. Este ciclo puede repetirse hasta 20 veces durante un período que dura semanas, aunque algunos métodos requieren muchos menos ciclos.
Estructura de un aptámero de ARN específico de biotina . La superficie del aptámero y la columna vertebral se muestran en amarillo. La biotina (esferas) encaja perfectamente en una cavidad de la superficie del ARN.

La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial ( SELEX ), también conocida como selección in vitro o evolución in vitro , es una técnica de química combinatoria en biología molecular para producir oligonucleótidos de ADN o ARN monocatenario que se unen específicamente a un ligando objetivo o ligandos. Estos ADN o ARN monocatenarios se denominan comúnmente aptámeros . [1] [2] [3] Aunque SELEX ha surgido como el nombre más comúnmente utilizado para el procedimiento, algunos investigadores se han referido a él como SAAB (sitio de unión seleccionado y amplificado) y CASTing (amplificación cíclica y selección de objetivos) [4 ] [5] SELEX se introdujo por primera vez en 1990. En 2015, se publicó un número especial en el Journal of Molecular Evolution en honor al cuarto de siglo del descubrimiento de SELEX. [6]

El proceso comienza con la síntesis de una biblioteca de oligonucleótidos muy grande, que consta de secuencias generadas aleatoriamente de longitud fija flanqueadas por extremos 5' y 3' constantes . Los extremos constantes sirven como cebadores , mientras que se espera que un pequeño número de regiones aleatorias se unan específicamente al objetivo elegido. Para una región de longitud n generada aleatoriamente , el número de secuencias posibles en la biblioteca que utiliza ADN o ARN convencional es 4 n ( n posiciones con cuatro posibilidades (A,T,C,G) en cada posición). Las secuencias de la biblioteca se exponen al ligando objetivo (que puede ser una proteína o un pequeño compuesto orgánico ) y aquellas que no se unen al objetivo se eliminan, normalmente mediante cromatografía de afinidad o captura del objetivo en perlas paramagnéticas. [7] Las secuencias unidas se eluyen y amplifican mediante PCR [2] [3] para prepararse para rondas de selección posteriores en las que se puede aumentar la rigurosidad de las condiciones de elución para identificar las secuencias con unión más estrecha. [2] Una precaución a considerar en este método es que la selección de entidades con afinidad de unión sub- nanomolar extremadamente alta puede, de hecho, no mejorar la especificidad para la molécula objetivo. [8] La unión fuera del objetivo a moléculas relacionadas podría tener efectos clínicos significativos.

SELEX se ha utilizado para desarrollar una serie de aptámeros que se unen a objetivos interesantes tanto para fines clínicos como de investigación. [9] Se han incorporado nucleótidos con azúcares y bases químicamente modificados a las reacciones SELEX para aumentar la diversidad química en cada base, ampliando las posibilidades de unión específica y sensible, o aumentando la estabilidad en suero o in vivo . [9] [10]

Procedimiento

Los aptámeros han surgido como una categoría novedosa en el campo de los biorreceptores debido a sus amplias aplicaciones que van desde la biodetección hasta la terapéutica. Se han informado varias variaciones de su proceso de selección, llamado SELEX, que pueden producir secuencias con las propiedades deseadas y necesarias para su uso final. [11]

Generación de biblioteca de oligonucleótidos monocatenarios

El primer paso de SELEX implica la síntesis de secuencias de oligonucleótidos total o parcialmente aleatorias de cierta longitud flanqueadas por regiones definidas que permiten la amplificación por PCR de esas regiones aleatorias y, en el caso de RNA SELEX, la transcripción in vitro de la secuencia aleatoria. [2] [3] [12] Si bien Ellington y Szostak demostraron que la síntesis química es capaz de generar ~10 15 secuencias únicas para bibliotecas de oligonucleótidos en su artículo de 1990 sobre selección in vitro, [3] encontraron que la amplificación de estos oligonucleótidos sintetizados condujo a una pérdida significativa de diversidad del conjunto debido al sesgo de la PCR y defectos en los fragmentos sintetizados. [3] El conjunto de oligonucleótidos se amplifica y se agrega una cantidad suficiente de la biblioteca inicial a la reacción para que haya numerosas copias de cada secuencia individual para minimizar la pérdida de posibles secuencias de unión debido a eventos estocásticos. [3] Antes de introducir la biblioteca en el objetivo para su incubación y retención selectiva, la biblioteca de secuencias debe convertirse en oligonucleótidos monocatenarios para lograr conformaciones estructurales con propiedades de unión al objetivo. [2] [3]

Incubación objetivo

Inmediatamente antes de la introducción del objetivo, la biblioteca de oligonucleótidos monocatenarios a menudo se calienta y enfría lentamente para renaturalizar los oligonucleótidos en estructuras secundarias y terciarias termodinámicamente estables. [3] [7] Una vez preparada, la biblioteca aleatoria se incuba con el objetivo inmovilizado para permitir la unión del oligonucleótido al objetivo. Hay varias consideraciones para este paso de incubación del objetivo, incluido el método de inmovilización del objetivo y las estrategias para la posterior separación de oligonucleótidos no unidos, el tiempo y la temperatura de incubación, las condiciones del tampón de incubación y las concentraciones del objetivo frente a los oligonucleótidos. Ejemplos de métodos de inmovilización de objetivos incluyen columnas de cromatografía de afinidad , [3] filtros de ensayo de unión de nitrocelulosa , [2] y perlas paramagnéticas. [7] Recientemente, se han desarrollado reacciones SELEX en las que el objetivo son células completas, que se expanden hasta alcanzar una confluencia casi completa y se incuban con la biblioteca de oligonucleótidos en placas de cultivo. [13] Las condiciones del tampón de incubación se modifican según el objetivo previsto y la función deseada del aptámero seleccionado. Por ejemplo, en el caso de proteínas y moléculas pequeñas cargadas negativamente, se utilizan tampones con alto contenido de sal para la detección de carga para permitir que los nucleótidos se acerquen al objetivo y aumenten la posibilidad de que se produzca un evento de unión específico. [3] Alternativamente, si la función deseada del aptámero es la unión a proteínas in vivo o a células completas para una posible aplicación terapéutica o diagnóstica, es más probable que las condiciones del tampón de incubación similares a las concentraciones de sal en plasma in vivo y las temperaturas homeostáticas generen aptámeros que puedan unirse in vivo. Otra consideración en las condiciones del buffer de incubación son los competidores no específicos. Si existe una alta probabilidad de retención de oligonucleótidos no específicos en las condiciones de reacción, se pueden usar competidores no específicos, que son moléculas pequeñas o polímeros distintos de la biblioteca SELEX que tienen propiedades físicas similares a los oligonucleótidos de la biblioteca, para ocupar estos oligonucleótidos no específicos. sitios de unión específicos. [13] Variar la concentración relativa de la diana y los oligonucleótidos también puede afectar las propiedades de los aptámeros seleccionados. Si una buena afinidad de unión por el aptámero seleccionado no es una preocupación, entonces se puede usar un exceso de diana para aumentar la probabilidad de que al menos algunas secuencias se unan durante la incubación y se retengan. Sin embargo, esto no proporciona presión selectiva para una alta afinidad de unión , lo que requiere que la biblioteca de oligonucleótidos esté en exceso para que haya competencia entre secuencias únicas por los sitios de unión específicos disponibles. [2]

Elución y amplificación de la secuencia de unión.

Una vez que la biblioteca de oligonucleótidos se ha incubado con la diana durante un tiempo suficiente, los oligonucleótidos no unidos se eliminan por lavado de la diana inmovilizada, a menudo utilizando el tampón de incubación para que se retengan los oligonucleótidos específicamente unidos. [3] Una vez eliminadas las secuencias no unidas, las secuencias específicamente unidas se eluyen creando condiciones desnaturalizantes que promueven el despliegue de oligonucleótidos o la pérdida de la conformación de unión, incluido el flujo en agua desionizada, [3] utilizando soluciones desnaturalizantes que contienen urea y EDTA, [13] [ 14] o aplicando mucho calor y fuerza física. [7] Tras la elución de las secuencias unidas, los oligonucleótidos retenidos se transcriben de forma inversa a ADN en el caso de ARN o selecciones de bases modificadas, [2] [3] [13] o simplemente se recogen para su amplificación en el caso de ADN SELEX. [15] Estas plantillas de ADN a partir de secuencias eluidas luego se amplifican mediante PCR y se convierten en ADN monocatenario, ARN u oligonucleótidos de bases modificadas, que se utilizan como entrada inicial para la siguiente ronda de selección. [2] [3]

Obtención de ADNss

Uno de los pasos más críticos en el procedimiento SELEX es la obtención de ADN monocatenario (ssDNA) después del paso de amplificación por PCR. Esto servirá como insumo para el siguiente ciclo por lo que es de vital importancia que todo el ADN sea monocatenario y se pierda la menor cantidad posible. Debido a su relativa simplicidad, uno de los métodos más utilizados es utilizar cebadores inversos biotinilados en la etapa de amplificación, después de lo cual las cadenas complementarias se pueden unir a una resina seguido de la elución de la otra cadena con lejía. Otro método es la PCR asimétrica, donde el paso de amplificación se realiza con un exceso de cebador directo y muy poco cebador inverso, lo que conduce a la producción de más cadena deseada. Un inconveniente de este método es que el producto debe purificarse a partir de ADN bicatenario (ADNbc) y otros materiales sobrantes de la reacción de PCR. La degradación enzimática de la cadena no deseada se puede realizar marcando esta cadena utilizando un cebador con sonda de fosfato, tal como lo reconocen enzimas como la exonucleasa Lambda . Luego, estas enzimas degradan selectivamente la cadena marcada con fosfato, dejando intacta la cadena complementaria. Todos estos métodos recuperan aproximadamente del 50 al 70% del ADN. Para una comparación detallada, consulte el artículo de Svobodová et al. donde estos y otros métodos se comparan experimentalmente. [16] En SELEX clásico, el proceso de generación aleatoria de bibliotecas monocatenarias, incubación del objetivo y elución y amplificación de la secuencia de unión descrito anteriormente se repite hasta que la gran mayoría del conjunto retenido consta de secuencias de unión al objetivo, [2] [3] aunque Hay modificaciones y adiciones al procedimiento que se utilizan con frecuencia, que se analizan a continuación.

Selección negativa o contraria

Para aumentar la especificidad de los aptámeros seleccionados mediante un procedimiento SELEX determinado, se puede agregar una etapa de selección negativa o contraselección antes o inmediatamente después de la incubación objetivo. Para eliminar secuencias con afinidad por los componentes de la matriz de inmovilización diana del conjunto, se puede utilizar selección negativa donde la biblioteca se incuba con componentes de la matriz de inmovilización diana y se retienen las secuencias no unidas. [14] [17] [15] La selección negativa también se puede utilizar para eliminar secuencias que se unen a moléculas o células similares al objetivo incubando la biblioteca de oligonucleótidos con moléculas pequeñas análogas objetivo, tipos de células no deseadas o proteínas no objetivo y reteniendo las moléculas no objetivo. secuencias. [13] [15] [18]

Seguimiento de la progresión de la selección

Para seguir el progreso de una reacción SELEX, el número de moléculas unidas al objetivo, que es equivalente al número de oligonucleótidos eluidos, se puede comparar con la entrada total estimada de oligonucleótidos después de la elución en cada ronda. [3] [19] El número de oligonucleótidos eluidos se puede estimar mediante estimaciones de la concentración de elución mediante absorbancia de longitud de onda de 260 nm [19] o marcaje fluorescente de oligonucleótidos. [7] A medida que la reacción SELEX se acerca a su finalización, la fracción de la biblioteca de oligonucleótidos que se une al objetivo se acerca al 100%, de modo que el número de moléculas eluidas se acerca a la estimación total de entrada de oligonucleótidos, pero puede converger en un número menor. [3]

Advertencias y consideraciones

Algunas reacciones SELEX pueden generar sondas que dependen de regiones de unión de cebadores para la formación de estructuras secundarias. [7] Hay aplicaciones de aptámeros para las que es deseable una secuencia corta y, por tanto, un truncamiento del cebador. [20] Un avance en el método original permite que una biblioteca de ARN omita las regiones del cebador constante, que pueden ser difíciles de eliminar después del proceso de selección porque estabilizan estructuras secundarias que son inestables cuando se forman solo por la región aleatoria. [21]

Nucleótidos modificados químicamente

Recientemente, SELEX se ha ampliado para incluir el uso de nucleótidos modificados químicamente. Estos oligonucleótidos modificados químicamente ofrecen muchas ventajas potenciales para aptámeros seleccionados, incluida una mayor estabilidad y resistencia a las nucleasas, una unión mejorada para objetivos seleccionados, propiedades físicas ampliadas, como una mayor hidrofobicidad, y conformaciones estructurales más diversas. [9] [10] [22]

El alfabeto genético, y por tanto los posibles aptámeros, también se expande utilizando pares de bases no naturales [23] [24]. El uso de estos pares de bases no naturales se aplicó a SELEX y se generaron aptámeros de ADN de alta afinidad. [25]

Variantes de SELEX y métodos alternativos de selección de aptámeros.

FRELEX fue desarrollado en 2016 por NeoVentures Biotechnology Inc para permitir la selección de aptámeros sin inmovilizar la diana o la biblioteca de oligonucleótidos. [26] La inmovilización es un componente necesario de SELEX; sin embargo, tiene el potencial de inhibir epítopos clave y, por lo tanto, debilitar la probabilidad de una unión exitosa, particularmente cuando se trabaja con moléculas pequeñas. [27] [28] FRELEX sigue una metodología general similar a SELEX; sin embargo, en lugar de inmovilizar el objetivo, el investigador introduce una serie de oligonucleótidos bloqueadores y aleatorios en un campo de inmovilización antes de la introducción en el objetivo. [26] Esto permite al investigador apuntar mejor a las moléculas pequeñas que pueden perderse durante la partición. [26] También se puede utilizar en algunas circunstancias para seleccionar una biblioteca de aptámeros sin conocer el objetivo. [29]

La mayoría de los métodos modernos de selección de aptámeros se esfuerzan por mejorar el método de búsqueda de aptámeros SELEX convencional. [30] A pesar de la publicación de varios métodos destinados a aumentar la afinidad y especificidad de los aptámeros, [31] [32] [33] los enfoques experimentales enfrentan limitaciones en el número y variedad de secuencias que pueden examinarse y seleccionarse. La capacidad de la biblioteca para experimentos SELEX está prácticamente limitada a 10 15 candidatos, mientras que, asumiendo que hay un repertorio de 4 monoméricos a partir del cual se pueden crear grupos, hay ~1,6 × 10 60 secuencias únicas en el espacio de secuencia limitado a una matriz de 100 residuos. lo cual está claramente más allá de las capacidades experimentales. [34] La biblioteca de oligonucleótidos debe ser extremadamente diversa y no contener estructuras lineales, incapaces de proporcionar una disposición espacial estable, ni estructuras bicatenarias; Debido a estas limitaciones, las bibliotecas de oligonucleótidos pueden cubrir la diversidad de sólo ~10 6 secuencias. [35] Esto significa que los aptámeros existentes pueden no cubrir completamente la diversidad de moléculas objetivo o pueden no tener propiedades óptimas debido a las limitaciones del método subyacente. Para producir los mejores aptámeros posibles se debe maximizar la eficacia del proceso de descubrimiento y de la biblioteca misma.

La predicción de la estructura secundaria de ARN y ADN mediante algoritmos de programación dinámica como RNAfold ( ViennaRNA ) [36] y mediante modelos de aprendizaje automático como SPOT-RNA, [37] MXfold2 [38] brinda la oportunidad de evaluar la capacidad de las secuencias en la biblioteca primaria. para plegarse en estructuras complejas, permitiendo la selección solo de las secuencias más prometedoras de todo el grupo. Sin embargo, estos algoritmos tienen un rendimiento bajo, lo que los hace poco adecuados para esta tarea. Por esta razón, se han desarrollado algoritmos como Ufold de la Universidad de California [39] y AliNA de Nanobiorobots Inc. [40] , que demuestran un aumento significativo en la velocidad computacional debido a su arquitectura más rápida, y pueden aplicarse para pruebas preliminares in silico. análisis de estas bibliotecas.

Objetivos previos

La técnica se ha utilizado para desarrollar aptámeros de afinidad de unión extremadamente alta a una variedad de ligandos objetivo, incluidas moléculas pequeñas como ATP [41] y adenosina [12] [42] y proteínas como priones [43] y factor de crecimiento endotelial vascular. (VEGF). [44] Además, SELEX se ha utilizado para seleccionar aptámeros de alta afinidad para objetivos complejos como células tumorales, [45] [46] exosomas tumorales, [47] [48] o tejido tumoral. [49] Los usos clínicos de la técnica son sugeridos por los aptámeros que se unen a marcadores tumorales , [50] fluoróforos relacionados con GFP , [51] y un aptámero de unión a VEGF con nombre comercial Macugen ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento de la degeneración macular . [44] [52] Además, SELEX se ha utilizado para obtener ADN catalítico o ADNzimas altamente específicos. Se han informado varias ADNzimas específicas de metales, incluida la ADNzima GR-5 (específica de plomo), [53] las ADNzimas CA1-3 (específicas de cobre), [54] la ADNzima 39E (específica de uranilo) [55] y la ADNzima NaA43 (específica del sodio). [56]

Estos aptámeros desarrollados han tenido diversas aplicaciones en terapias para la degeneración macular [52] y diversas aplicaciones de investigación, incluidos biosensores , [20] etiquetado fluorescente de proteínas [57] y células, [58] e inhibición enzimática selectiva. [59]

Ver también

Referencias

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