Los multímeros de MHC son formas oligoméricas de moléculas de MHC , diseñadas para identificar y aislar células T con alta afinidad a antígenos específicos en medio de un gran grupo de células T no relacionadas. [1] Los multímeros generalmente varían en tamaño desde dímeros hasta octámeros; sin embargo, algunas empresas utilizan cantidades incluso mayores de MHC por multímero. Los multímeros se pueden utilizar para mostrar MHC de clase 1 , MHC de clase 2 o moléculas no clásicas (p. ej., CD1d ) de especies como monos, ratones y humanos.
Dado que los receptores de células T tienen una baja afinidad por sus homólogos MHC, históricamente era problemático etiquetar células T de manera efectiva utilizando interacciones individuales MHC-célula T. [2] Sin embargo, en 1996, John Altman propuso utilizar un complejo de múltiples moléculas MHC para formar un enlace más estable entre las células T correspondientes. [3]
Los multímeros de MHC más utilizados son los tetrámeros. [3] Estos se producen típicamente mediante la biotinilación de monómeros solubles de MHC, que normalmente se producen de forma recombinante en células eucariotas o bacterianas. Estos monómeros luego se unen a una cadena principal, como estreptavidina o avidina , creando una estructura tetravalente. Estas cadenas principales se conjugan con fluorocromos para posteriormente aislar las células T unidas mediante citometría de flujo . [4]
Los multímeros MHC permiten un nivel de especificidad hasta ahora inalcanzable en la detección y aislamiento de células T específicas de antígenos. Esta capacidad da lugar a varias aplicaciones clínicas. Los multímeros MHC permiten la selección y proliferación ex vivo de células T específicas de antígenos virales o relacionados con tumores, que luego pueden reintroducirse para aumentar el sistema inmunológico. Los multímeros MHC también se pueden utilizar para eliminar células T originadas en injertos en órganos trasplantados, ex vivo. Los multímeros MHC también se pueden utilizar para eliminar células T dañinas o no deseadas in vivo, como las que se dirigen a células propias y conducen a enfermedades autoinmunes. [4] [5] [6] La inmunoterapia contra el cáncer y el desarrollo de vacunas también pueden verse influenciados en gran medida por esta tecnología. [7]
Los tetrámeros de MHC consisten en cuatro moléculas de MHC, un agente de tetramerización y una proteína marcada con fluorescencia (generalmente estreptavidina). También se han generado estreptavidinas con 6 o 12 sitios de unión para MHC. [8] Los tetrámeros de MHC se utilizan para identificar y marcar células T específicas mediante la unión específica de epítopos, lo que permite analizar la respuesta inmune específica del antígeno tanto en modelos animales como en humanos. [9] Los tetrámeros de MHC se desarrollaron originalmente utilizando moléculas de MHC de clase I para el reconocimiento de células T citotóxicas , [10] [11] pero durante la última década han permitido el reconocimiento de células T CD4 por una amplia variedad de antígenos. Los ensayos de tetrámeros se utilizan para el fenotipado de células individuales y el recuento de células, y ofrecen una ventaja importante sobre otros métodos, como ELISPOT y PCR de células individuales porque permiten la recuperación y el estudio adicional de células clasificadas. Como aplicación basada en citometría de flujo, los tetrámeros también son fáciles de usar y tienen un tiempo de ensayo corto, similar a los estudios de citometría de flujo basados en anticuerpos. [4]
Los tetrámeros MHC se utilizan en estudios de inmunidad a patógenos y desarrollo de vacunas, en la evaluación de respuestas antitumorales, en estudios de monitoreo de alergias y desensibilización, y en autoinmunidad. [4] [12] Proporcionan un medio ideal para caracterizar las células T que responden a una vacuna, y se han utilizado para probar las respuestas de las células T en muchos sistemas de vacunas, incluyendo influenza , [13] fiebre amarilla , [14] tuberculosis , [15] VIH / VIS [16] y una gran cantidad de ensayos de vacunas contra el cáncer, [17] incluyendo melanoma y leucemia mieloide crónica . [18] Los tetrámeros de clase II se han utilizado para el análisis de una variedad de respuestas de células T CD4 humanas a patógenos, incluyendo influenza A , Borrelia , virus de Epstein-Barr , CMV , Mycobacterium tuberculosis , virus linfotrópico T humano 1 , hepatitis C , ántrax , virus del síndrome respiratorio agudo severo , virus del papiloma humano y VIH. [4] Se han desarrollado variantes de tetrámeros que, ya sea radiomarcados o acoplados a una toxina como la saporina , se pueden inyectar en ratones vivos para modular o incluso agotar poblaciones específicas de células T. [19] [20] Los tetrámeros de péptidos-MHC también se han utilizado terapéuticamente. [21] Por ejemplo, las células T específicas del citomegalovirus se han enriquecido a altos niveles de pureza utilizando enriquecimiento basado en perlas magnéticas para su uso como terapia para pacientes con trasplante de células madre . [12]
Los pentámeros constan de cinco grupos de cabezas de péptidos del MHC, dispuestos en una configuración plana de modo que, a diferencia de los tetrámeros del MHC, todos los grupos de cabezas pueden entrar en contacto con la célula T CD8+. Los grupos de cabezas están conectados a través de enlaces flexibles a un dominio de multimerización de bobina superenrollada , que a su vez está conectado a cinco etiquetas fluorescentes o de biotina. Los pentámeros están disponibles con marcado APC, R-PE o biotina, y también sin marcar con etiquetas separadas para almacenamiento a largo plazo. Los pentámeros ofrecen un brillo y una avidez de tinción mejorados en comparación con otros reactivos multímeros.
Los pentámeros MHC se han utilizado en la detección de células T CD8+ específicas de antígeno en citometría de flujo, [12] y se citan en más de 750 publicaciones revisadas por pares [1], incluidas varias en las revistas Nature [22] y Science . [23] [24] Los pentámeros MHC también se pueden utilizar en la tinción de tejidos, [25] y en el aislamiento magnético de células T específicas de antígeno. [26]
Si bien los pentámeros están autorizados solo para uso en investigación, en 2009 se otorgó una dispensa especial para que un equipo los utilizara para aislar células T específicas del VEB para la transferencia de madre a hija, para el tratamiento vital del linfoma asociado al VEB en la hija. [27]
Los pentámeros están disponibles para antígenos de las siguientes enfermedades: adenovirus , VHC , malaria , SIV , enfermedades autoinmunes , VIH , antígenos de trasplante, tripanosoma , cáncer , VPH , tuberculosis , clamidia , HTLV , vaccinia , CMV , influenza , VSV , EBV , LCMV , RSV , virus del Nilo Occidental , VHB , Listeria , virus Sendai , fiebre amarilla . También se pueden encargar pentámeros con especificidad personalizada.
Los pentámeros se utilizan actualmente en investigaciones académicas, industriales y médicas, y las investigaciones que utilizan pentámeros han aparecido en los medios internacionales [2][3] en varias ocasiones.
Una forma de multímero MHC desarrollado y registrado por la empresa de biotecnología danesa Immudex en 2002. Los reactivos de dextrámero están marcados con fluorescencia con FITC, PE o APC y contienen moléculas MHC unidas a una cadena principal de dextrano , que se utilizan para detectar células T específicas de antígeno en células fluidas y muestras de tejido sólido mediante citometría de flujo. Estas células T contienen receptores de células T (TCR) que reconocen un complejo MHC-péptido específico que se muestra en la superficie de las células presentadoras de antígeno , lo que permite la detección, el aislamiento y la cuantificación de estas poblaciones específicas de células T debido a una relación señal-ruido mejorada que no estaba presente en generaciones anteriores de multímeros. [3] [12] [28]
Los reactivos Dextramer ® se han desarrollado con una mayor cantidad de péptidos MHC para varios genes humanos, de ratón y de macaco rhesus involucrados en enfermedades que incluyen, entre otras: cáncer , VIH , virus de Epstein-Barr (VEB), citomegalovirus (CMV), LCMV, virus del papiloma humano (VPH), poliomavirus BK , HTLV, hepatitis , micobacterias y enfermedad de injerto contra huésped .
La tecnología de dextrámeros se utiliza actualmente en la investigación académica y clínica debido a su mayor especificidad y afinidad de unión, lo que permite una mayor avidez por células T específicas y mejora la intensidad de la tinción. Esta ventaja es el resultado de la mayor capacidad de los dextrámeros para unirse varias veces a una sola célula T, lo que mejora la estabilidad de esta interacción en comparación con otras tecnologías de multímeros, como los pentámeros y los tetrámeros. Otras aplicaciones incluyen la capacidad de aislar poblaciones de células T específicas de antígenos, así como la detección in situ mediante inmunohistoquímica (IHC) para varios estados patológicos (por ejemplo, tumores sólidos). Por lo tanto, estos reactivos son importantes para el desarrollo futuro de medicamentos y vacunas. [1] [12] [28] [29] [30]
Immudex desarrolló un ensayo CMV Dextramer ® para la detección exploratoria y cuantificación de células T CD8+ en muestras de sangre, que cubre una amplia gama de epítopos para ayudar con la detección y el monitoreo de la progresión del CMV en futuros entornos clínicos. [31] Los reactivos MHC Dextramer ® están disponibles con moléculas MHC clase I y MHC clase II. [32]