La microscopía confocal , más frecuentemente microscopía de barrido láser confocal ( CLSM ) o microscopía confocal de barrido láser ( LSCM ), es una técnica de imágenes ópticas para aumentar la resolución óptica y el contraste de una micrografía mediante el uso de un orificio espacial para bloquear la luz desenfocada. en la formación de imágenes. [1] La captura de múltiples imágenes bidimensionales a diferentes profundidades en una muestra permite la reconstrucción de estructuras tridimensionales (un proceso conocido como seccionamiento óptico ) dentro de un objeto. Esta técnica se utiliza ampliamente en las comunidades científica e industrial y las aplicaciones típicas son las ciencias biológicas , la inspección de semiconductores y la ciencia de materiales .
La luz viaja a través de la muestra bajo un microscopio convencional hasta donde puede penetrar, mientras que un microscopio confocal solo enfoca un haz de luz más pequeño en un nivel de profundidad estrecho a la vez. El CLSM logra una profundidad de campo controlada y muy limitada.
El principio de imagen confocal fue patentado en 1957 por Marvin Minsky [2] y tiene como objetivo superar algunas limitaciones de los microscopios de fluorescencia de campo amplio tradicionales . [3] En un microscopio de fluorescencia convencional (es decir, de campo amplio) , toda la muestra se inunda uniformemente con luz procedente de una fuente de luz. Todas las partes de la muestra se pueden excitar al mismo tiempo y la fluorescencia resultante se detecta mediante el fotodetector o la cámara del microscopio , incluida una gran parte de fondo desenfocada. Por el contrario, un microscopio confocal utiliza iluminación puntual (consulte Función de dispersión de puntos ) y un orificio en un plano ópticamente conjugado frente al detector para eliminar la señal desenfocada; el nombre "confocal" proviene de esta configuración. Como sólo se puede detectar la luz producida por fluorescencia muy cerca del plano focal , la resolución óptica de la imagen , especialmente en la dirección de profundidad de la muestra, es mucho mejor que la de los microscopios de campo amplio. Sin embargo, como gran parte de la luz de la fluorescencia de la muestra se bloquea en el orificio, esta mayor resolución tiene el costo de una menor intensidad de la señal, por lo que a menudo se requieren exposiciones prolongadas. Para compensar esta caída de la señal después del agujero , la intensidad de la luz es detectada por un detector sensible, generalmente un tubo fotomultiplicador (PMT) o fotodiodo de avalancha , transformando la señal luminosa en eléctrica. [4]
Como sólo se ilumina un punto de la muestra a la vez, las imágenes 2D o 3D requieren escanear sobre una trama regular (es decir, un patrón rectangular de líneas de escaneo paralelas) en la muestra. El haz se escanea a través de la muestra en el plano horizontal utilizando uno o más espejos oscilantes ( servocontrolados ). Este método de escaneo suele tener una latencia de reacción baja y la velocidad de escaneo se puede variar. Los escaneos más lentos proporcionan una mejor relación señal-ruido , lo que resulta en un mejor contraste .
El espesor alcanzable del plano focal se define principalmente por la longitud de onda de la luz utilizada dividida por la apertura numérica de la lente del objetivo , pero también por las propiedades ópticas de la muestra. El fino corte óptico posible hace que este tipo de microscopios sean particularmente buenos para obtener imágenes en 3D y perfilar superficies de muestras.
Los cortes sucesivos forman una 'pila z', que puede procesarse para crear una imagen 3D o fusionarse en una pila 2D (predominantemente se toma la intensidad máxima de píxeles; otros métodos comunes incluyen el uso de la desviación estándar o la suma de las píxeles). [1]
La microscopía confocal proporciona la capacidad de realizar un corte óptico en serie directo, no invasivo, de muestras vivas, gruesas e intactas con una preparación mínima de la muestra, así como una mejora marginal en la resolución lateral en comparación con la microscopía de campo amplio. [4] Las muestras biológicas a menudo se tratan con tintes fluorescentes para hacer visibles los objetos seleccionados. Sin embargo, la concentración real de tinte puede ser baja para minimizar la alteración de los sistemas biológicos: algunos instrumentos pueden rastrear moléculas fluorescentes individuales. Además, las técnicas transgénicas pueden crear organismos que produzcan sus propias moléculas quiméricas fluorescentes (como una fusión de GFP, proteína verde fluorescente con la proteína de interés). Los microscopios confocales funcionan según el principio de excitación puntual en la muestra (punto de difracción limitada) y detección puntual de la señal fluorescente resultante. Un orificio en el detector proporciona una barrera física que bloquea la fluorescencia desenfocada. Sólo se registra el punto enfocado o central del disco Airy .
Se encuentran disponibles comercialmente cuatro tipos de microscopios confocales:
Los microscopios confocales de escaneo láser utilizan múltiples espejos (generalmente 2 o 3 que escanean linealmente a lo largo de los ejes x e y) para escanear el láser a través de la muestra y "desescanear" la imagen a través de un orificio fijo y un detector. Este proceso suele ser lento y no funciona para imágenes en vivo, pero puede resultar útil para crear imágenes representativas de alta resolución de muestras fijas .
Los microscopios confocales de disco giratorio ( disco de Nipkow ) utilizan una serie de orificios móviles en un disco para escanear puntos de luz. Dado que una serie de orificios escanea un área en paralelo, cada orificio puede flotar sobre un área específica durante un período de tiempo más largo, lo que reduce la energía de excitación necesaria para iluminar una muestra en comparación con los microscopios de escaneo láser. La disminución de la energía de excitación reduce la fototoxicidad y el fotoblanqueo de una muestra, lo que a menudo la convierte en el sistema preferido para obtener imágenes de células u organismos vivos.
Los microscopios confocales de disco giratorio dual o mejorados con microlentes funcionan según los mismos principios que los microscopios confocales de disco giratorio, excepto que se coloca un segundo disco giratorio que contiene microlentes antes del disco giratorio que contiene los orificios. Cada agujero tiene una microlente asociada. Las microlentes actúan para capturar una amplia banda de luz y enfocarla en cada orificio, aumentando significativamente la cantidad de luz dirigida a cada orificio y reduciendo la cantidad de luz bloqueada por el disco giratorio. Por lo tanto, los microscopios confocales mejorados con microlentes son significativamente más sensibles que los sistemas de disco giratorio estándar. Yokogawa Electric inventó esta tecnología en 1992. [5]
Los microscopios de matriz programables (PAM) utilizan un modulador de luz espacial (SLM) controlado electrónicamente que produce un conjunto de poros en movimiento. El SLM es un dispositivo que contiene una matriz de píxeles con alguna propiedad ( opacidad , reflectividad o rotación óptica ) de los píxeles individuales que se puede ajustar electrónicamente. El SLM contiene espejos microelectromecánicos o componentes de cristal líquido . La imagen normalmente se adquiere mediante una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD).
Cada una de estas clases de microscopio confocal tiene ventajas y desventajas particulares. La mayoría de los sistemas están optimizados para la velocidad de grabación (es decir, captura de vídeo) o para una alta resolución espacial. Los microscopios de barrido láser confocales pueden tener una densidad de muestreo programable y resoluciones muy altas, mientras que Nipkow y PAM utilizan una densidad de muestreo fija definida por la resolución de la cámara. Las velocidades de cuadro de imágenes suelen ser más lentas para los sistemas de escaneo láser de un solo punto que para los sistemas de disco giratorio o PAM. Los microscopios confocales de disco giratorio comerciales alcanzan velocidades de cuadro de más de 50 por segundo [6] , una característica deseable para observaciones dinámicas como imágenes de células vivas.
En la práctica, Nipkow y PAM permiten que múltiples orificios escaneen la misma área en paralelo [7] siempre que los orificios estén lo suficientemente separados.
El desarrollo de vanguardia de la microscopía de escaneo láser confocal ahora permite obtener imágenes con una velocidad de video mejor que la estándar (60 cuadros por segundo) mediante el uso de múltiples espejos de escaneo microelectromecánicos.
La obtención de imágenes confocales de fluorescencia de rayos X es una técnica más nueva que permite controlar la profundidad, además de apuntar horizontal y verticalmente, por ejemplo, al analizar capas enterradas en una pintura. [8]
CLSM es una técnica de escaneo de imágenes en la que la resolución obtenida se explica mejor comparándola con otra técnica de escaneo como la del microscopio electrónico de barrido (SEM). CLSM tiene la ventaja de no requerir que una sonda esté suspendida a nanómetros de la superficie, como en un AFM o STM , por ejemplo, donde la imagen se obtiene escaneando con una punta fina sobre una superficie. La distancia desde la lente del objetivo a la superficie (llamada distancia de trabajo ) suele ser comparable a la de un microscopio óptico convencional. Varía según el diseño óptico del sistema, pero son típicas distancias de trabajo desde cientos de micrómetros hasta varios milímetros.
En CLSM, una muestra se ilumina mediante una fuente láser puntual y cada elemento de volumen se asocia con una dispersión discreta o una intensidad de fluorescencia. Aquí, el tamaño del volumen de escaneo está determinado por el tamaño del punto (cerca del límite de difracción ) del sistema óptico porque la imagen del láser de escaneo no es un punto infinitamente pequeño sino un patrón de difracción tridimensional. El tamaño de este patrón de difracción y el volumen focal que define está controlado por la apertura numérica de la lente objetivo del sistema y la longitud de onda del láser utilizado. Esto puede verse como el límite de resolución clásico de los microscopios ópticos convencionales que utilizan iluminación de campo amplio. Sin embargo, con la microscopía confocal es incluso posible mejorar el límite de resolución de las técnicas de iluminación de campo amplio porque la apertura confocal se puede cerrar para eliminar órdenes superiores del patrón de difracción [ cita necesaria ] . Por ejemplo, si el diámetro del orificio se establece en 1 unidad Airy , entonces solo el primer orden del patrón de difracción pasa a través de la apertura hasta el detector, mientras que los órdenes superiores están bloqueados, mejorando así la resolución a costa de una ligera disminución del brillo. En las observaciones de fluorescencia, el límite de resolución de la microscopía confocal a menudo está limitado por la relación señal-ruido causada por la pequeña cantidad de fotones típicamente disponibles en la microscopía de fluorescencia. Se puede compensar este efecto utilizando fotodetectores más sensibles o aumentando la intensidad de la fuente puntual del láser iluminador. Al aumentar la intensidad de la iluminación láser se corre el riesgo de blanqueamiento excesivo u otros daños a la muestra de interés, especialmente para experimentos en los que se requiere una comparación del brillo de la fluorescencia. Cuando se obtienen imágenes de tejidos que tienen una refracción diferencial, como el mesófilo esponjoso de las hojas de las plantas u otros tejidos que contienen espacios aéreos, a menudo se pronuncian aberraciones esféricas que afectan la calidad de la imagen confocal. Sin embargo, tales aberraciones pueden reducirse significativamente montando muestras en perfluorocarbonos ópticamente transparentes y no tóxicos, como la perfluorodecalina , que se infiltra fácilmente en los tejidos y tiene un índice de refracción casi idéntico al del agua. [9]
CLSM se utiliza ampliamente en diversas disciplinas de las ciencias biológicas , desde biología celular y genética hasta microbiología y biología del desarrollo . [10] También se utiliza en óptica cuántica e imágenes y espectroscopia de nanocristales.
Clínicamente, CLSM se utiliza en la evaluación de diversas enfermedades oculares y es particularmente útil para imágenes, análisis cualitativo y cuantificación de células endoteliales de la córnea . [11] Se utiliza para localizar e identificar la presencia de elementos fúngicos filamentosos en el estroma corneal en casos de queratomicosis , lo que permite un diagnóstico rápido y, por lo tanto, la institución temprana de una terapia definitiva. La investigación sobre técnicas CLSM para procedimientos endoscópicos ( endomicroscopía ) también se muestra prometedora. [12] En la industria farmacéutica, se recomendó seguir el proceso de fabricación de formas farmacéuticas de película delgada, para controlar la calidad y uniformidad de la distribución de los medicamentos. [13] La microscopía confocal también se utiliza para estudiar biopelículas : estructuras porosas complejas que son el hábitat preferido de los microorganismos. Algunas de las funciones temporales y espaciales de las biopelículas sólo pueden entenderse estudiando su estructura a escala micro y meso. El estudio de microescala es necesario para detectar la actividad y organización de microorganismos individuales. [14]
CLSM se utiliza como mecanismo de recuperación de datos en algunos sistemas de almacenamiento de datos ópticos 3D y ha ayudado a determinar la edad del papiro de Magdalena .
El sistema IRENE utiliza microscopía confocal para el escaneo óptico y la recuperación de audio histórico dañado. [15]
Los microscopios confocales de barrido láser se utilizan en la caracterización de la superficie de materiales microestructurados, como las obleas de silicio utilizadas en la producción de células solares . Durante los primeros pasos del procesamiento, las obleas se graban químicamente en húmedo con compuestos ácidos o alcalinos, dando textura a su superficie. Luego se utiliza microscopía confocal láser para observar el estado de la superficie resultante en la palanca del micrómetro. La microscopía confocal láser también se puede utilizar para analizar el grosor y la altura de los dedos de metalización impresos en la parte superior de las células solares.
La función de dispersión puntual del orificio es un elipsoide, varias veces más largo que ancho. Esto limita la resolución axial del microscopio. Una técnica para superar esto es la microscopía 4Pi , donde se permite que la luz incidente o emitida interfiera tanto desde arriba como desde debajo de la muestra para reducir el volumen del elipsoide. Una técnica alternativa es la microscopía theta confocal . En esta técnica, el cono de luz iluminadora y la luz detectada forman un ángulo entre sí (los mejores resultados son cuando están perpendiculares). La intersección de las dos funciones de dispersión de puntos da un volumen de muestra efectivo mucho menor. A partir de aquí evolucionó el microscopio de iluminación de un solo plano . Además, se puede emplear la deconvolución utilizando una función de dispersión de puntos derivada experimentalmente para eliminar la luz desenfocada, mejorando el contraste tanto en el plano axial como en el lateral.
Existen variantes confocales que logran una resolución por debajo del límite de difracción, como la microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED). Además de esta técnica, hay disponibles una amplia variedad de otras técnicas de superresolución (no basadas en confocales) como PALM, (d)STORM , SIM, etc. Todos tienen sus propias ventajas, como la facilidad de uso, la resolución y la necesidad de equipos especiales, tampones o fluoróforos.
Para obtener imágenes de muestras a bajas temperaturas, se han utilizado dos enfoques principales, ambos basados en la arquitectura de microscopía confocal de barrido láser . Un enfoque es utilizar un criostato de flujo continuo : solo la muestra está a baja temperatura y se dirige ópticamente a través de una ventana transparente. [16] Otro enfoque posible es tener parte de la óptica (especialmente el objetivo del microscopio) en un recipiente de almacenamiento criogénico . [17] Este segundo enfoque, aunque más engorroso, garantiza una mejor estabilidad mecánica y evita las pérdidas debidas a la ventana.
Para estudiar las interacciones moleculares utilizando el CLSM, la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se puede utilizar para confirmar que dos proteínas se encuentran a una cierta distancia entre sí.
.tif/lossless-page1-1280px-Mitotic_spindle_in_Arabidopsis_primary_root_meristem_cells_(anaphase).tif.png)
En 1940, Hans Goldmann, oftalmólogo de Berna , Suiza, desarrolló un sistema de lámpara de hendidura para documentar los exámenes oculares. [18] Este sistema es considerado por algunos autores posteriores como el primer sistema óptico confocal. [19] [20]
En 1943 Zyun Koana publicó un sistema confocal. [21] [19]
En 1951, Hiroto Naora, un colega de Koana, describió un microscopio confocal en la revista Science para espectrofotometría . [22]
El primer microscopio de barrido confocal fue construido por Marvin Minsky en 1955 y se presentó una patente en 1957. El escaneo del punto de iluminación en el plano focal se lograba moviendo la platina. No se presentó ninguna publicación científica y no se conservaron imágenes realizadas con ella. [2] [23]
En los años 60, el checoslovaco Mojmír Petráň de la Facultad de Medicina de la Universidad Carolina de Pilsen desarrolló el microscopio de barrido en tándem, el primer microscopio confocal comercializado. Fue vendido por una pequeña empresa en Checoslovaquia y en los Estados Unidos por Tracor-Northern (más tarde Noran) y utilizaba un disco giratorio de Nipkow para generar múltiples orificios de excitación y emisión. [20] [24]
La patente checoslovaca fue presentada en 1966 por Petráň y Milan Hadravský, un compañero de trabajo checoslovaco. Una primera publicación científica con datos e imágenes generadas con este microscopio se publicó en la revista Science en 1967, cuyo autor fue M. David Egger de la Universidad de Yale y Petráň. [25] Como nota a pie de página de este artículo se menciona que Petráň diseñó el microscopio y supervisó su construcción y que fue, en parte, un "investigador asociado" en Yale. Una segunda publicación de 1968 describió la teoría y los detalles técnicos del instrumento y tuvo como autores adicionales a Hadravský y Robert Galambos , el jefe del grupo en Yale. [26] En 1970 se concedió la patente estadounidense. Fue presentado en 1967. [27]
En 1969 y 1971, M. David Egger y Paul Davidovits de la Universidad de Yale publicaron dos artículos que describen el primer microscopio de barrido láser confocal. [28] [29] Era un escáner de puntos, lo que significa que solo se generaba un punto de iluminación. Utilizó microscopía de epi-iluminación-reflexión para la observación del tejido nervioso. Un láser de helio-neón de 5 mW con luz de 633 nm fue reflejado por un espejo semitransparente hacia el objetivo. El objetivo era una lente simple con una distancia focal de 8,5 mm. A diferencia de todos los sistemas anteriores y posteriores, la muestra se escaneaba mediante el movimiento de esta lente (escaneo objetivo), lo que provocaba un movimiento del punto focal. La luz reflejada regresaba al espejo semitransparente, la parte transmitida era enfocada por otra lente en el orificio de detección detrás del cual estaba colocado un tubo fotomultiplicador. La señal fue visualizada mediante un CRT de un osciloscopio, el rayo catódico se movió simultáneamente con el objetivo. Un dispositivo especial permitió tomar fotografías Polaroid , tres de las cuales se mostraron en la publicación de 1971.
Los autores especulan sobre tintes fluorescentes para investigaciones in vivo . Citan la patente de Minsky y agradecen a Steve Baer, en aquel momento estudiante de doctorado en la Escuela de Medicina Albert Einstein de la ciudad de Nueva York , donde desarrolló un microscopio de barrido lineal confocal, [30] por sugerir el uso de un láser con el 'microscopio de Minsky' y Agradezco a Galambos, Hadravsky y Petráň por las discusiones que llevaron al desarrollo de su microscopio. La motivación para su desarrollo fue que en el microscopio de barrido en tándem sólo una fracción de 10 −7 de la luz de iluminación participa en la generación de la imagen en el ocular. Por tanto, la calidad de la imagen no fue suficiente para la mayoría de las investigaciones biológicas. [19] [31]
En 1977, Colin JR Sheppard y Amarjyoti Choudhury , Oxford , Reino Unido, publicaron un análisis teórico de los microscopios confocales y de barrido láser. [32] Es probablemente la primera publicación que utiliza el término "microscopio confocal". [19] [31]
En 1978, los hermanos Christoph Cremer y Thomas Cremer publicaron un diseño para un microscopio de barrido láser confocal que utiliza excitación fluorescente con enfoque automático electrónico. También sugirieron una iluminación de puntos láser mediante el uso de un " holograma de 4π puntos ". [31] [33] Este diseño del CLSM combinó por primera vez el método de escaneo láser con la detección 3D de objetos biológicos etiquetados con marcadores fluorescentes .
En 1978 y 1980, el grupo de Oxford formado por Colin Sheppard y Tony Wilson describió un microscopio confocal con iluminación epiláser, escaneo de platina y tubos fotomultiplicadores como detectores. El escenario podría moverse a lo largo del eje óptico (eje z), permitiendo secciones ópticas en serie. [31]
En 1979, Fred Brakenhoff y sus colaboradores demostraron que las ventajas teóricas del seccionamiento óptico y la mejora de la resolución se pueden lograr en la práctica. En 1985, este grupo se convirtió en el primero en publicar imágenes convincentes tomadas con un microscopio confocal que podían responder preguntas biológicas. [34] Poco después, muchos más grupos comenzaron a utilizar la microscopía confocal para responder preguntas científicas que hasta entonces habían permanecido como un misterio debido a limitaciones tecnológicas.
En 1983, IJ Cox y C. Sheppard de Oxford publicaron el primer trabajo en el que un microscopio confocal era controlado por un ordenador. El primer microscopio de barrido láser comercial, el escáner de escenario SOM-25, fue ofrecido por Oxford Optoelectronics (después de varias adquisiciones adquiridas por BioRad) a partir de 1982. Se basó en el diseño del grupo Oxford. [20] [35]
A mediados de la década de 1980, William Bradshaw Amos y John Graham White y sus colegas que trabajaban en el Laboratorio de Biología Molecular de Cambridge construyeron el primer microscopio de barrido de haz confocal. [36] [37] El escenario con la muestra no se movía, sino el punto de iluminación, lo que permitió una adquisición de imágenes más rápida: cuatro imágenes por segundo con 512 líneas cada una. Las imágenes intermedias enormemente ampliadas, debido a una trayectoria del haz de 1 a 2 metros de largo, permitieron el uso de un diafragma de iris convencional como un "orificio", con diámetros de aproximadamente 1 mm. Las primeras micrografías se tomaron con una exposición prolongada en película antes de agregar una cámara digital. Una mejora adicional permitió por primera vez acercarse a la preparación. Zeiss , Leitz y Cambridge Instruments no tenían ningún interés en una producción comercial. [38] El Consejo de Investigación Médica (MRC) finalmente patrocinó el desarrollo de un prototipo. El diseño fue adquirido por Bio-Rad , modificado con control informático y comercializado como 'MRC 500'. El sucesor MRC 600 fue más tarde la base para el desarrollo del primer microscopio fluorescente de dos fotones desarrollado en 1990 en la Universidad de Cornell . [34]
Casi al mismo tiempo, los avances en el KTH Royal Institute of Technology de Estocolmo dieron lugar a un CLSM comercial distribuido por la empresa sueca Sarastro. [39] La empresa fue adquirida en 1990 por Molecular Dynamics, [40] pero el CLSM finalmente se suspendió. En Alemania, Heidelberg Instruments, fundada en 1984, desarrolló un CLSM, que inicialmente estaba destinado a aplicaciones industriales más que a la biología. Este instrumento pasó a manos de Leica Lasertechnik en 1990 . Zeiss ya tenía en el mercado un microscopio de barrido láser de punto volador no confocal que se actualizó a confocal. Un informe de 1990 [41] menciona algunos fabricantes de confocales: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern y Zeiss. [34]
En 1989, Fritz Karl Preikschat y su hijo Ekhard Preikschat inventaron el microscopio de diodo láser de barrido para el análisis del tamaño de partículas. [42] [43] y cofundó Lasentec para comercializarlo. En 2001, Lasentec fue adquirida por Mettler Toledo . [44] Se utilizan principalmente en la industria farmacéutica para proporcionar control in situ del proceso de cristalización en grandes sistemas de purificación.
En los instrumentos confocales estándar, el segundo orificio o "salida" se utiliza para filtrar la luz emitida o dispersada. Tradicionalmente, este orificio es un componente pasivo que bloquea la luz para filtrar la iluminación ópticamente. Sin embargo, los diseños más nuevos han intentado realizar este filtrado digitalmente.
Enfoques recientes han reemplazado el orificio pasivo con un elemento detector compuesto. Normalmente, después del procesamiento digital, este enfoque conduce a una mejor resolución y presupuesto de fotones, ya que el límite de resolución puede acercarse al de un agujero infinitamente pequeño. [45]
Otros investigadores han intentado reenfocar digitalmente la luz desde una fuente de excitación puntual utilizando redes neuronales convolucionales profundas. [46]
{{cite journal}}: Faltante o vacío |title=( ayuda ) El artículo está disponible en la web de la revista. El archivo pdf con la etiqueta "P359 - 402" tiene un tamaño de 19.020 kilobytes y también contiene artículos vecinos del mismo número. La figura 1b del artículo muestra el esquema de una trayectoria de haz de transmisión confocal.