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Anticuerpo de dominio único

Diagrama de cinta de un dominio V H H de llama . El bucle CDR3 extendido está coloreado en naranja.

Un anticuerpo de dominio único ( sdAb ), también conocido como nanocuerpo , es un fragmento de anticuerpo que consiste en un solo dominio variable de anticuerpo monomérico . Al igual que un anticuerpo completo, es capaz de unirse selectivamente a un antígeno específico . Con un peso molecular de solo 12-15 kDa , los anticuerpos de dominio único son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kDa) que se componen de dos cadenas proteicas pesadas y dos cadenas ligeras , e incluso más pequeños que los fragmentos Fab (~50 kDa, una cadena ligera y media cadena pesada) y los fragmentos variables de cadena única (~25 kDa, dos dominios variables, uno de una cadena ligera y otro de una cadena pesada). [1]

Los primeros anticuerpos de dominio único se diseñaron a partir de anticuerpos de cadena pesada encontrados en camélidos ; estos se llaman fragmentos V H H . Los peces cartilaginosos también tienen anticuerpos de cadena pesada (IgNAR, 'receptor de antígeno nuevo de inmunoglobulina'), de los cuales se pueden obtener anticuerpos de dominio único llamados fragmentos V NAR . [2] Un enfoque alternativo es dividir los dominios variables diméricos de la inmunoglobulina G (IgG) común de humanos o ratones en monómeros. Aunque la mayoría de la investigación sobre anticuerpos de dominio único se basa actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha demostrado que los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopos objetivo . [3]

Se ha demostrado que los nanoanticuerpos de camélidos son tan específicos como los anticuerpos y, en algunos casos, son más robustos. Se aíslan fácilmente utilizando el mismo procedimiento de selección de fagos que se utiliza para los anticuerpos, lo que permite cultivarlos in vitro en grandes concentraciones. Su menor tamaño y dominio único hacen que estos anticuerpos sean más fáciles de transformar en células bacterianas para su producción en masa, lo que los hace ideales para fines de investigación. [4]

Los anticuerpos de dominio único se están investigando para múltiples aplicaciones farmacéuticas y tienen potencial para usarse en el tratamiento del síndrome coronario agudo , el cáncer , la enfermedad de Alzheimer , [5] [6] y Covid-19 . [7] [8] [9]

Propiedades

Un anticuerpo de dominio único es una cadena peptídica de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud, que comprende un dominio variable (V H ) de un anticuerpo de cadena pesada o de una IgG común. Estos péptidos tienen una afinidad similar a los antígenos como los anticuerpos completos, pero son más resistentes al calor y estables frente a los detergentes y altas concentraciones de urea . Los derivados de anticuerpos de camélidos y peces son menos lipofílicos y más solubles en agua, debido a su región determinante de complementariedad 3 (CDR3), que forma un bucle extendido (de color naranja en el diagrama de cintas anterior) que cubre el sitio lipofílico que normalmente se une a una cadena ligera. [10] [11] A diferencia de los anticuerpos comunes, dos de cada seis anticuerpos de dominio único sobrevivieron a una temperatura de 90 °C (194 °F) sin perder su capacidad de unirse a antígenos en un estudio de 1999. [12] La estabilidad frente al ácido gástrico y las proteasas depende de la secuencia de aminoácidos. Se ha demostrado que algunas especies son activas en el intestino después de la aplicación oral, [13] [14] pero su baja absorción en el intestino impide el desarrollo de anticuerpos de dominio único administrados por vía oral sistémicamente activos.

El complejo de un anticuerpo de dominio único y un antígeno proteico revela un sitio de unión oculto. [15] ( izquierda ) El dominio único NAR V del tiburón nodriza en complejo con lisozima (PDB 1T6V). ( derecha ) El Fv humanizado HyHEL-10 en complejo con lisozima (PDB 2EIZ)

La masa molecular comparativamente baja conduce a una mejor permeabilidad en los tejidos y a una vida media plasmática corta, ya que se eliminan por vía renal . [1] A diferencia de los anticuerpos completos, no muestran citotoxicidad desencadenada por el sistema del complemento porque carecen de una región Fc . Los sdAb derivados de camélidos y peces pueden unirse a antígenos ocultos que no son accesibles a los anticuerpos completos, por ejemplo, a los sitios activos de las enzimas . [15] Se ha demostrado que esta propiedad es el resultado de su bucle CDR3 extendido, que puede penetrar dichos sitios ocultos. [11] [16] [15]

Producción

Un anticuerpo de cadena pesada de tiburón (izquierda) y un camélido (centro) en comparación con un anticuerpo común (derecha). Las cadenas pesadas se muestran en un tono más oscuro, las cadenas ligeras en un tono más claro. VH y VL son los dominios variables.

De anticuerpos de cadena pesada

Se puede obtener un anticuerpo de dominio único mediante la inmunización de dromedarios , camellos , llamas , alpacas o tiburones con el antígeno deseado y el posterior aislamiento del ARNm que codifica la región variable (V NAR y V H H) de los anticuerpos de cadena pesada. Se establecieron grandes bibliotecas de dominio único V NAR y V H H presentadas en fagos a partir de tiburones nodriza [17] y camellos dromedarios. [18] [19] Las técnicas de detección como la presentación en fagos y la presentación en ribosomas ayudan a identificar los clones que se unen al antígeno. [20] [17] [21] [18] [22] [8] [19] Los anticuerpos de dominio único que incluyen V NAR se pueden humanizar para aplicaciones clínicas. [23]

De anticuerpos convencionales

Como alternativa, los anticuerpos de dominio único se pueden fabricar a partir de IgG murina común , [24] de conejo [25] o humana [26] con cuatro cadenas. [27] El proceso es similar, y comprende bibliotecas de genes de donantes inmunizados o ingenuos y técnicas de visualización para la identificación de los antígenos más específicos. Un problema con este enfoque es que la región de unión de la IgG común consta de dos dominios (V H y V L ), que tienden a dimerizarse o agregarse debido a su lipofilicidad. La monomerización generalmente se logra reemplazando aminoácidos lipofílicos por hidrófilos, pero a menudo resulta en una pérdida de afinidad con el antígeno. [28] Si se puede conservar la afinidad, los anticuerpos de dominio único también se pueden producir en E. coli , [25] [26] [29] S. cerevisiae u otros organismos.

A partir de anticuerpos humanos de dominio único

Los seres humanos producen ocasionalmente anticuerpos de dominio único mediante la creación aleatoria de un codón de terminación en la cadena ligera. Los anticuerpos humanos de dominio único dirigidos a varios antígenos tumorales, incluidos la mesotelina, [29] GPC2 [30] y GPC3 [26] [31] se aislaron mediante visualización de fagos. Los anticuerpos humanos de dominio único HN3 se han utilizado para crear inmunotoxinas [31] [32] [33] y células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) [34] para tratar el cáncer de hígado. El bloqueo del dominio de unión de Wnt de GPC3 por el anticuerpo humano de dominio único HN3 inhibe la activación de Wnt en las células de cáncer de hígado. [35]

Aplicaciones potenciales

Los anticuerpos de dominio único permiten una amplia gama de aplicaciones tanto en uso biotecnológico como terapéutico debido a su pequeño tamaño, producción sencilla y alta afinidad. [36] [37] [15]

Biotecnológico y diagnóstico

La fusión de una proteína fluorescente con un nanocuerpo genera un llamado cromocuerpo. Los cromocuerpos se pueden utilizar para reconocer y rastrear objetivos en diferentes compartimentos de células vivas. Por lo tanto, pueden aumentar las posibilidades de la microscopía de células vivas y permitirán nuevos estudios funcionales. [38] El acoplamiento de un nanocuerpo anti- GFP a una matriz monovalente, llamada nanotrampa GFP, permite el aislamiento de proteínas de fusión GFP y sus socios interactuantes para análisis bioquímicos posteriores. [39] La localización de moléculas individuales con técnicas de imágenes de súper resolución requiere la administración específica de fluoróforos en estrecha proximidad con una proteína objetivo. Debido a su gran tamaño, el uso de anticuerpos acoplados a tintes orgánicos a menudo puede conducir a una señal engañosa debido a la distancia entre el fluoróforo y la proteína objetivo. La fusión de tintes orgánicos a nanocuerpos anti-GFP dirigidos a proteínas marcadas con GFP permite una resolución espacial nanométrica y un error de enlace mínimo debido al pequeño tamaño y la alta afinidad. [40] El tamaño de los nanocuerpos también beneficia el estudio correlativo de microscopía electrónica y óptica . Sin ningún agente de permeabilización, el citoplasma de las células fijadas químicamente es fácilmente accesible para los nanocuerpos marcados con fluoróforos. Su pequeño tamaño también les permite penetrar más profundamente en muestras volumétricas que los anticuerpos regulares. La alta calidad ultraestructural se conserva en el tejido que se visualiza mediante microscopio de fluorescencia y luego microscopio electrónico. Esto es especialmente útil para la investigación en neurociencia que requiere tanto el etiquetado molecular como la obtención de imágenes mediante microscopio electrónico. [41]

En aplicaciones de biosensores de diagnóstico , los nanocuerpos pueden utilizarse prospectivamente como una herramienta. Debido a su pequeño tamaño, pueden acoplarse más densamente en superficies de biosensores. Además de su ventaja en la selección de epítopos menos accesibles, su estabilidad conformacional también conduce a una mayor resistencia a las condiciones de regeneración de la superficie. Después de inmovilizar anticuerpos de dominio único en superficies de sensores que detectan el antígeno prostático específico humano (hPSA), se probaron. Los nanocuerpos superaron a los anticuerpos clásicos en la detección de concentraciones clínicamente significativas de hPSA. [42]

Para aumentar la probabilidad de cristalización de una molécula objetivo, los nanocuerpos pueden utilizarse como chaperonas de cristalización . Como proteínas auxiliares, pueden reducir la heterogeneidad conformacional al unirse y estabilizar solo un subconjunto de estados conformacionales. También pueden enmascarar superficies que interfieren con la cristalización al tiempo que extienden regiones que forman contactos cristalinos. [43] [37]

Terapéutico

Nanocuerpos para terapia fototérmica. Los nanocuerpos, que pueden unirse a antígenos tumorales como HER2 , se acoplan a nanopartículas de oro ramificadas que absorben la energía de la luz y crean calor para matar las células cancerosas.

Los anticuerpos de dominio único se han probado como una nueva herramienta terapéutica contra múltiples objetivos. En ratones infectados con el subtipo H5N1 del virus de la influenza A , los nanocuerpos dirigidos contra la hemaglutinina suprimieron la replicación del virus H5N1 in vivo y redujeron la morbilidad y la mortalidad. [44] Se ha demostrado que los nanocuerpos dirigidos al dominio de unión al receptor celular de los factores de virulencia toxina A y toxina B de Clostridium difficile neutralizan los efectos citopáticos en fibroblastos in vitro . [45] Los conjugados de nanocuerpos que reconocen células presentadoras de antígenos se han utilizado con éxito para la detección de tumores [46] o la administración dirigida de antígenos para generar una fuerte respuesta inmunitaria. [47]

Se han desarrollado y probado con éxito anticuerpos de dominio único disponibles por vía oral contra la diarrea inducida por E. coli en lechones. [14] Otras enfermedades del tracto gastrointestinal , como la enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer de colon , también son posibles objetivos para los anticuerpos de dominio único disponibles por vía oral. [48]

Se han diseñado especies estables a los detergentes que se dirigen a una proteína de superficie de Malassezia furfur para su uso en champús anticaspa . [10]

Como método de terapia fototérmica, se conjugaron nanocuerpos que se unen al antígeno HER2 , que se sobreexpresa en células de cáncer de mama y ovario, con nanopartículas de oro ramificadas (véase la figura). Las células tumorales se destruyeron fototérmicamente utilizando un láser en un entorno de prueba. [49]

El caplacizumab , un anticuerpo de dominio único dirigido al factor de von Willebrand, se encuentra en ensayos clínicos para la prevención de la trombosis en pacientes con síndrome coronario agudo. [50] En septiembre de 2009 se inició un estudio de fase II que examina el ALX-0081 en intervenciones coronarias percutáneas de alto riesgo . [51]

Ablynx espera que sus nanocuerpos puedan atravesar la barrera hematoencefálica y penetrar en tumores sólidos de gran tamaño con mayor facilidad que los anticuerpos completos, lo que permitiría el desarrollo de fármacos contra los cánceres cerebrales . [48]

Recientemente se han identificado nanocuerpos que se unen firmemente al dominio RBD de la proteína de pico de los betacoronavirus (incluido el SARS-CoV-2 que causa COVID-19 ) y bloquean las interacciones de la proteína de pico con el receptor celular ACE2 [52] [18]

Se ha informado sobre la aplicación de varios anticuerpos de dominio único (nanocuerpos) para la prevención y el tratamiento de la infección por varios coronavirus humanos altamente patógenos (HPhCoV). Recientemente se han destacado las perspectivas, la potencia y los desafíos de implementar nanocuerpos para unirse y neutralizar el SARS-CoV-2 y similares. [53]

Una de las causas más comunes de nagana , Trypanosoma brucei brucei , puede ser atacada por sdAbs. Stijlemans et al. 2004 lograron inducir sdAbs efectivos en conejos y Camelus dromedarius mostrando un antígeno de glucoproteína de superficie variable a los sistemas inmunológicos de los vertebrados utilizando un fago. En el futuro, estas terapias superarán a los anticuerpos naturales al llegar a lugares actualmente inalcanzables debido al mayor tamaño de los anticuerpos naturales. [54]

Referencias

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