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Desoxinucleotidil transferasa terminal

La desoxinucleotidil transferasa terminal ( TdT ), también conocida como ADN nucleotidilexotransferasa ( DNTT ) o transferasa terminal , es una ADN polimerasa especializada expresada en células linfoides inmaduras, pre-B, pre-T y células de leucemia linfoblástica aguda /linfoma. La TdT añade N-nucleótidos a los exones V, D y J de los genes TCR y BCR durante la recombinación génica de anticuerpos , lo que permite el fenómeno de la diversidad de unión . En los seres humanos, la transferasa terminal está codificada por el gen DNTT . [5] [6] Como miembro de la familia X de enzimas ADN polimerasas , funciona junto con la polimerasa λ y la polimerasa μ, ambas pertenecientes a la misma familia X de enzimas polimerasas. La diversidad introducida por la TdT ha desempeñado un papel importante en la evolución del sistema inmunológico de los vertebrados, aumentando significativamente la variedad de receptores de antígenos con los que está equipada una célula para combatir patógenos. Estudios realizados con ratones knock out para TdT han encontrado reducciones drásticas (de 10 veces) en la diversidad del receptor de células T (TCR) en comparación con la de los sistemas normales o de tipo salvaje. La mayor diversidad de TCR con los que está equipado un organismo conduce a una mayor resistencia a las infecciones. [7] [8] Aunque la TdT fue una de las primeras ADN polimerasas identificadas en mamíferos en 1960, [9] sigue siendo una de las ADN polimerasas menos comprendidas de todas. [7] En 2016-18, se descubrió que la TdT demostraba un comportamiento dependiente de la plantilla in trans , además de su comportamiento independiente de la plantilla, más conocido [10] [11]

La TdT está ausente en las células madre hematopoyéticas del hígado fetal , lo que afecta significativamente la diversidad de unión en las células B durante el período fetal. [12]

Función y regulación

En general, la TdT cataliza la adición de nucleótidos al extremo 3' de una molécula de ADN . A diferencia de la mayoría de las ADN polimerasas, no requiere una plantilla. El sustrato preferido de esta enzima es un saliente 3' , pero también puede agregar nucleótidos a extremos 3' romos o hundidos. Además, la TdT es la única polimerasa que se sabe que cataliza la síntesis de polímeros de ADN de 2-15 nt a partir de nucleótidos libres en solución in vivo . [13] In vitro , este comportamiento cataliza la formación general de polímeros de ADN sin longitud específica. [14] Se plantea la hipótesis de que los fragmentos de ADN de 2-15 nt producidos in vivo actúan en vías de señalización relacionadas con la maquinaria de reparación y/o recombinación del ADN. [13] Al igual que muchas polimerasas, TdT requiere un cofactor catión divalente , [15] sin embargo, TdT es única en su capacidad de utilizar una gama más amplia de cationes como Mg 2+ , Mn 2+ , Zn 2+ y Co 2+ . [15] La tasa de actividad enzimática depende de los cationes divalentes disponibles y del nucleótido que se agrega. [16]

La TdT se expresa principalmente en los órganos linfoides primarios, como el timo y la médula ósea. La regulación de su expresión se produce a través de múltiples vías. Estas incluyen interacciones proteína-proteína, como las que se producen con TdIF1. TdIF1 es otra proteína que interactúa con TdT para inhibir su función enmascarando la región de unión al ADN de la polimerasa TdT. La regulación de la expresión de TdT también existe a nivel transcripcional, con una regulación influenciada por factores específicos de la etapa, y se produce de una manera restrictiva del desarrollo. [7] [17] [18] Aunque la expresión se encuentra típicamente en los órganos linfoides primarios, trabajos recientes han sugerido que la estimulación a través del antígeno puede resultar en la expresión secundaria de TdT junto con otras enzimas necesarias para la reorganización genética fuera del timo para las células T. [19] Los pacientes con leucemia linfoblástica aguda producen en gran medida TdT. [16] Las líneas celulares derivadas de estos pacientes sirvieron como una de las primeras fuentes de TdT pura y condujeron al descubrimiento de que existen diferencias en la actividad entre las isoformas humanas y bovinas. [16]

Mecanismo

Gráfico que describe el mecanismo de condensación de nucleotidilo con ssDNA catalizado por la desoxinucleotidil transferasa terminal con cofactores de cationes divalentes. Dos residuos de aspartato facilitan la unión de cationes y el ataque nucleofílico .

Al igual que muchas polimerasas , el sitio catalítico de TdT tiene dos cationes divalentes en su dominio de palma que ayudan en la unión de nucleótidos, ayudan a reducir el pKa del grupo 3'-OH y, en última instancia, facilitan la salida del subproducto pirofosfato resultante. [20] [21]

Variación de isoformas

Se han observado varias isoformas de TdT en ratones, bovinos y humanos. Hasta la fecha, se han identificado dos variantes en ratones y tres en humanos. [22]

Las dos variantes de empalme identificadas en ratones se nombran según sus longitudes respectivas: TdTS consta de 509 aminoácidos mientras que TdTL, la variante más larga, consta de 529 aminoácidos. Las diferencias entre TdTS y TdTL ocurren fuera de las regiones que unen el ADN y los nucleótidos. El hecho de que la diferencia de 20 aminoácidos afecte a la actividad enzimática es controvertido, ya que algunos argumentan que las modificaciones de TdTL confieren actividad exonucleasa, mientras que otros argumentan que TdTL y TdTS tienen una actividad in vitro casi idéntica . Además, se informa que TdTL puede modular la actividad catalítica de TdTS in vivo a través de un mecanismo desconocido. Se sugiere que esto ayuda a regular el papel de TdT en la recombinación V(D)J. [23]

Las isoformas de TdT humanas tienen tres variantes: TdTL1, TdTL2 y TdTS. La TdTL1 se expresa ampliamente en líneas celulares linfoides, mientras que la TdTL2 se expresa predominantemente en linfocitos pequeños normales. Ambas se localizan en el núcleo cuando se expresan [24] y ambas poseen actividad exonucleasa 3'->5'. [25] Por el contrario, las isoformas de TdTS no poseen actividad exonucleasa y realizan la elongación necesaria durante la recombinación V(D)J. [25] Dado que se encuentra una actividad exonucleasa similar hipotetizada en la TdTL murina en la TdTL humana y bovina, algunos postulan que las isoformas de TdTL bovina y humana regulan las isoformas de TdTS de una manera similar a la propuesta en ratones. [23] Además, algunos plantean la hipótesis de que la TdTL1 puede estar involucrada en la regulación de la actividad de TdTL2 y/o TdTS.

Papel en la recombinación V(D)J

Esta imagen muestra el mecanismo explicado en el artículo.
Esta imagen proporciona una representación visual de cómo funciona la TdT en el proceso de reordenamiento de genes de anticuerpos. Tenga en cuenta que, aunque la imagen utiliza segmentos D y J, el mismo tipo de reordenamientos también se produce con otros pares de segmentos.

Tras la acción de las enzimas RAG 1/2, el ADN bicatenario escindido queda con estructuras de horquilla al final de cada segmento de ADN creado por el evento de escisión. Las horquillas se abren mediante el complejo Artemis , que tiene actividad endonucleasa cuando se fosforila, proporcionando los extremos 3' OH libres para que actúe la TdT. Una vez que el complejo Artemis ha hecho su trabajo y ha añadido nucleótidos palindrómicos (nucleótidos P) a las horquillas de ADN recién abiertas, el escenario está listo para que la TdT haga su trabajo. Ahora la TdT puede entrar y añadir nucleótidos N a los nucleótidos P existentes en una dirección de 5' a 3' que se sabe que funcionan las polimerasas. En promedio, se añaden de 2 a 5 pares de bases aleatorios a cada extremo 3' generado después de la acción del complejo Artemis. La cantidad de bases añadidas es suficiente para que los dos segmentos de ssDNA recién sintetizados experimenten una alineación de microhomología durante la unión de extremos no homólogos de acuerdo con los patrones normales de emparejamiento de bases de Watson-Crick (AT, CG). A partir de ahí, los nucleótidos no apareados son escindidos por una exonucleasa, como el complejo Artemis (que tiene actividad exonucleasa además de actividad endonucleasa), y luego las polimerasas dependientes de la plantilla pueden llenar los huecos, creando finalmente la nueva unión codificante con la acción de la ligasa para combinar los segmentos. Aunque TdT no discrimina entre los cuatro pares de bases al agregarlos a los segmentos de N-nucleótidos, ha mostrado un sesgo por los pares de bases de guanina y citosina . [7]

Actividad dependiente de plantilla

TDT unido a tres cadenas de ADN demostrando la configuración activa de su catálisis dependiente de plantilla.

De manera dependiente de la plantilla, la TdT puede incorporar nucleótidos a través de las roturas de hebras en el ADN bicatenario de una manera denominada en trans, en contraste con el mecanismo en cis que se encuentra en la mayoría de las polimerasas. Esto ocurre de manera óptima con una rotura de un par de bases entre hebras y menos con una brecha creciente. Esto se facilita mediante una subsección de la TdT llamada Loop1 que busca selectivamente roturas cortas en el ADN bicatenario. Además, el descubrimiento de esta actividad dependiente de la plantilla ha llevado a hipótesis mecanicistas más convincentes sobre cómo surge la distribución de longitudes de las adiciones de las regiones N en la recombinación V(D)J. [26]

Diagrama gráfico que muestra la actividad dependiente de la plantilla in trans de la desoxinucleotidil transferasa terminal. Loop1 está resaltado en rojo.

La polimerasa μ y la polimerasa λ exhiben una actividad sintética dependiente de la plantilla trans similar a la de TdT, pero sin una dependencia similar del ADN bicatenario corriente abajo. [27] Además, también se ha descubierto que la polimerasa λ exhibe una actividad sintética independiente de la plantilla similar. Junto con la actividad como transferasa terminal, se sabe que también funciona de una manera más general dependiente de la plantilla. [28] Las similitudes entre TdT y la polimerasa μ sugieren que están estrechamente relacionadas evolutivamente. [26]

Usos

La transferasa terminal tiene aplicaciones en biología molecular . Se puede utilizar en RACE para añadir nucleótidos que luego se pueden utilizar como plantilla para un cebador en PCR posterior . También se puede utilizar para añadir nucleótidos marcados con isótopos radiactivos , por ejemplo en el ensayo TUNEL ( Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP N ick End Labeling ) para la demostración de la apoptosis (que está marcada, en parte, por ADN fragmentado ). También se utiliza en el ensayo de inmunofluorescencia para el diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda . [29]

En inmunohistoquímica y citometría de flujo, los anticuerpos anti-TdT se pueden utilizar para demostrar la presencia de células T y B inmaduras y células madre hematopoyéticas pluripotentes , que poseen el antígeno, mientras que las células linfoides maduras son siempre negativas a la TdT. Si bien las células TdT positivas se encuentran en pequeñas cantidades en los ganglios linfáticos y las amígdalas sanos, las células malignas de la leucemia linfoblástica aguda también son positivas a la TdT y, por lo tanto, el anticuerpo se puede utilizar como parte de un panel para diagnosticar esta enfermedad y distinguirla, por ejemplo, de los tumores de células pequeñas de la infancia. [30]

La TdT también se ha aplicado recientemente en la síntesis De Novo de oligonucleótidos, con análogos unidos a TdT-dNTP capaces de extender el cebador de a 1 nt por vez. [31] En otras palabras, la enzima TdT ha demostrado la capacidad de producir ADN sintético añadiendo una letra a la vez a una secuencia de cebadores.

Véase también

Referencias

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Lectura adicional

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