La tripsina es una enzima en la primera sección del intestino delgado que inicia la digestión de moléculas de proteínas cortando largas cadenas de aminoácidos en trozos más pequeños. Es una serina proteasa de la superfamilia del clan PA , que se encuentra en el sistema digestivo de muchos vertebrados , donde hidroliza proteínas . [2] [3] La tripsina se forma en el intestino delgado cuando se activa su forma proenzimática , el tripsinógeno producido por el páncreas . La tripsina corta cadenas peptídicas principalmente en el lado carboxilo de los aminoácidos lisina o arginina . Se utiliza para numerosos procesos biotecnológicos . El proceso se conoce comúnmente como proteólisis o tripsinización de tripsinógeno , y se dice que las proteínas que han sido digeridas/tratadas con tripsina han sido tripsinizadas. [4] La tripsina fue descubierta en 1876 por Wilhelm Kühne y recibió su nombre de la palabra griega antigua que significa frotar, ya que se aisló por primera vez frotando el páncreas con glicerina . [5]
En el duodeno , la tripsina cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos , descomponiendo las proteínas en péptidos más pequeños. Luego, los productos peptídicos se hidrolizan aún más en aminoácidos a través de otras proteasas, dejándolos disponibles para su absorción en el torrente sanguíneo. La digestión tríptica es un paso necesario en la absorción de proteínas, ya que las proteínas generalmente son demasiado grandes para ser absorbidas a través del revestimiento del intestino delgado . [6]
La tripsina se produce como el zimógeno tripsinógeno inactivo en el páncreas. Cuando el páncreas es estimulado por la colecistoquinina , luego se secreta en la primera parte del intestino delgado (el duodeno ) a través del conducto pancreático . Una vez en el intestino delgado, la enzima enteroquinasa (también llamada enteropeptidasa) activa el tripsinógeno en tripsina mediante escisión proteolítica . La tripsina luego activa tripsina, quimotripsina y carboxipeptidasa adicionales .
El mecanismo enzimático es similar al de otras serina proteasas. Estas enzimas contienen una tríada catalítica que consta de histidina -57, aspartato -102 y serina -195. [7] Esta tríada catalítica anteriormente se llamaba sistema de retransmisión de carga, lo que implicaba la abstracción de protones de serina a histidina y de histidina a aspartato, pero debido a la evidencia proporcionada por RMN de que la forma alcóxido resultante de serina tendría una atracción mucho más fuerte sobre el protón que el anillo de imidazol de la histidina, el pensamiento actual sostiene en cambio que la serina y la histidina tienen efectivamente una proporción igual del protón, formando enlaces cortos de hidrógeno de baja barrera con ellos. [8] [ página necesaria ] Por estos medios, se aumenta la nucleofilia del sitio activo serina, facilitando su ataque al carbono amida durante la proteólisis. La reacción enzimática que cataliza la tripsina es termodinámicamente favorable, pero requiere una energía de activación significativa (es " cinéticamente desfavorable"). Además, la tripsina contiene un "agujero oxianión" formado por los átomos de hidrógeno de la amida principal de Gly-193 y Ser-195, que a través de enlaces de hidrógeno estabilizan la carga negativa que se acumula en el oxígeno de la amida después del ataque nucleofílico al carbono de la amida plana por parte del El oxígeno serina hace que el carbono adopte una geometría tetraédrica. Tal estabilización de este intermedio tetraédrico ayuda a reducir la barrera energética de su formación y es concomitante con una disminución de la energía libre del estado de transición. La unión preferencial del estado de transición es una característica clave de la química enzimática.
El residuo de aspartato negativo (Asp 189) ubicado en la bolsa catalítica (S1) de la tripsina es responsable de atraer y estabilizar la lisina y/o arginina con carga positiva y, por lo tanto, es responsable de la especificidad de la enzima. Esto significa que la tripsina escinde predominantemente proteínas en el lado carboxilo (o " lado C-terminal ") de los aminoácidos lisina y arginina, excepto cuando cualquiera de ellos está unido a una prolina C-terminal , [9] aunque los datos de espectrometría de masas a gran escala sugieren la escisión ocurre incluso con prolina. [10] La tripsina se considera una endopeptidasa , es decir, la escisión se produce dentro de la cadena polipeptídica en lugar de en los aminoácidos terminales ubicados en los extremos de los polipéptidos .
La tripsina humana tiene una temperatura de funcionamiento óptima de aproximadamente 37 °C. [11] Por el contrario, el bacalao del Atlántico tiene varios tipos de tripsinas para que los peces poiquilotermos sobrevivan a diferentes temperaturas corporales. Las tripsinas de bacalao incluyen la tripsina I con un rango de actividad de 4 a 65 °C (40 a 150 °F) y actividad máxima a 55 °C (130 °F), así como la tripsina Y con un rango de 2 a 30 °C ( 36 a 86 °F) y una actividad máxima a 21 °C (70 °F). [12]
Como proteína, la tripsina tiene varios pesos moleculares según la fuente. Por ejemplo, se informa un peso molecular de 23,3 kDa para la tripsina de origen bovino y porcino.
La actividad de la tripsina no se ve afectada por el inhibidor enzimático tosil fenilalanil clorometil cetona, TPCK , que desactiva la quimotripsina .
La tripsina debe almacenarse a temperaturas muy frías (entre -20 y -80 °C) para evitar la autólisis , que también puede verse impedida por el almacenamiento de tripsina a pH 3 o mediante el uso de tripsina modificada por metilación reductora. Cuando el pH se ajusta nuevamente a pH 8, la actividad regresa.
Estos genes humanos codifican proteínas con actividad enzimática tripsina:
También se pueden encontrar otras isoformas de tripsina en otros organismos.
La activación de la tripsina a partir de la escisión proteolítica del tripsinógeno en el páncreas puede provocar una serie de eventos que causan la autodigestión pancreática, lo que resulta en pancreatitis . Una consecuencia de la fibrosis quística , enfermedad autosómica recesiva , es una deficiencia en el transporte de tripsina y otras enzimas digestivas desde el páncreas. Esto conduce al trastorno denominado íleo meconial , que implica obstrucción intestinal ( íleo ) debido a un meconio demasiado espeso , que normalmente se descompone mediante tripsina y otras proteasas y luego se elimina con las heces. [13]
La tripsina está disponible en grandes cantidades en el páncreas y puede purificarse con bastante facilidad. De ahí que se haya utilizado ampliamente en diversos procesos biotecnológicos.
En un laboratorio de cultivo de tejidos , la tripsina se utiliza para resuspender las células adheridas a la pared de la placa de cultivo celular durante el proceso de recolección de células. [14] Algunos tipos de células se adhieren a los lados y al fondo de un plato cuando se cultivan in vitro . La tripsina se utiliza para escindir las proteínas que sujetan las células cultivadas a la placa, de modo que las células puedan retirarse de las placas.
La tripsina también se puede utilizar para disociar células disecadas (por ejemplo, antes de la fijación y clasificación de las células).
La tripsina se puede utilizar para descomponer la caseína de la leche materna. Si se añade tripsina a una solución de leche en polvo, la descomposición de la caseína hace que la leche se vuelva traslúcida . La velocidad de reacción se puede medir utilizando la cantidad de tiempo necesaria para que la leche se vuelva translúcida.
La tripsina se usa comúnmente en la investigación biológica durante experimentos proteómicos para digerir proteínas en péptidos para análisis de espectrometría de masas, por ejemplo, digestión en gel . La tripsina es particularmente adecuada para esto, ya que tiene una especificidad muy bien definida, ya que hidroliza sólo los enlaces peptídicos en los que el grupo carbonilo es aportado por un residuo de arginina o lisina.
La tripsina también se puede utilizar para disolver coágulos de sangre en su forma microbiana y tratar la inflamación en su forma pancreática.
En medicina veterinaria, la tripsina es un ingrediente de los productos en aerosol para heridas, como Debrisol, para disolver el tejido muerto y el pus en las heridas de caballos, ganado vacuno, perros y gatos. [15]
Las preparaciones comerciales de proteasas suelen consistir en una mezcla de varias enzimas proteasas que a menudo incluyen tripsina. Estas preparaciones se utilizan ampliamente en el procesamiento de alimentos: [16]
Para prevenir la acción de la tripsina activa en el páncreas, que puede ser muy dañina, están presentes inhibidores como BPTI y SPINK1 en el páncreas y α1-antitripsina en el suero como parte de la defensa contra su activación inadecuada. Cualquier tripsina formada prematuramente a partir del tripsinógeno inactivo queda entonces unida al inhibidor. La interacción proteína-proteína entre la tripsina y sus inhibidores es una de las más estrechas, y algunos de sus inhibidores pancreáticos unen la tripsina de forma casi irreversible. [17] A diferencia de casi todos los conjuntos de proteínas conocidos, algunos complejos de tripsina unidos por sus inhibidores no se disocian fácilmente después del tratamiento con urea 8M. [18]
Los inhibidores de tripsina pueden servir como herramientas para abordar los trastornos metabólicos y la obesidad. Se sabe que los trastornos metabólicos, la obesidad y el sobrepeso aumentan la prevalencia de enfermedades crónicas no transmisibles. [19] Es de interés para las políticas de salud pública explorar varias formas de mitigar este fenómeno, incluido el uso de inhibidores de tripsina. Estos inhibidores tienen la capacidad de reducir el cáncer de colon, mama, piel y próstata mediante actividad radioprotectora y anticancerígena. Los inhibidores de tripsina pueden actuar como mecanismos reguladores para controlar la liberación de proteasas de neutrófilos y evitar daños tisulares importantes. [19] En lo que respecta a las afecciones cardiovasculares asociadas con la actividad improductiva de la serina proteasa, los inhibidores de tripsina pueden bloquear su actividad en la agregación plaquetaria, la fibrinólisis, la coagulación y la coagulación sanguínea.
La multifuncionalidad de los inhibidores de tripsina incluye ser inhibidores potenciales de proteasa para la actividad de AMP. [20] Si bien los mecanismos de acción antibacteriana de los inhibidores de tripsina no están claros, los estudios han tenido como objetivo estudiar sus mecanismos como posibles aplicaciones en tratamientos de infecciones bacterianas. [20] La investigación y la microscopía de barrido mostraron efectos antibacterianos en las membranas bacterianas de Staphylococcus aureus. [20] Los inhibidores de tripsina de la piel de anfibios mostraron una promoción de la muerte bacteriana que afectó la pared celular y la membrana de Staphylococcus aureus. [20] Los estudios también analizaron las acciones antibacterianas en péptidos inhibidores de tripsina, proteínas y E. coli. Los resultados mostraron una prevención suficiente del crecimiento bacteriano. Sin embargo, los inhibidores de tripsina deben cumplir ciertos criterios para poder utilizarse en alimentos y tratamientos médicos. [20]
La digestión con tripsina de la matriz extracelular es una práctica común en el cultivo celular. Sin embargo, esta degradación enzimática de las células puede afectar negativamente a la viabilidad celular y a los marcadores de superficie, especialmente en las células madre. Existen alternativas más suaves que la tripsina, como Accutase, que no afecta a los marcadores de superficie como cd14, cd117, cd49f, cd292. [21] [22] Sin embargo, Accutase disminuye los niveles superficiales de FasL y del receptor Fas en los macrófagos ; estos receptores están asociados con la citotoxicidad celular en el sistema inmunológico y también pueden facilitar la muerte celular relacionada con la apoptosis . [23]
ProAlanase también podría servir como alternativa a la tripsina en aplicaciones proteómicas. [24] ProAlanase es una proteasa del hongo Aspergillus niger que puede lograr una alta actividad proteolítica y especificidad para la digestión en las condiciones correctas. [24] ProAnalase, la proteasa prolil-endopeptidasa ácida, previamente estudiada como An-PEP, se ha observado en varios experimentos para definir su especificidad. [24] ProAnalase funcionó de manera óptima en aplicaciones LC-MS con tiempos de digestión cortos y pH altamente ácido. [24]
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