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Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa

PCR en tiempo real

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa ( RT-PCR ) es una técnica de laboratorio que combina la transcripción inversa de ARN en ADN (en este contexto llamado ADN complementario o ADNc) y la amplificación de dianas específicas de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [1] Se utiliza principalmente para medir la cantidad de un ARN específico. Esto se logra monitoreando la reacción de amplificación usando fluorescencia, una técnica llamada PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). Puede surgir confusión porque algunos autores usan el acrónimo RT-PCR para denotar PCR en tiempo real. En este artículo, RT-PCR denotará PCR de transcripción inversa. La RT-PCR y la qPCR combinadas se utilizan rutinariamente para el análisis de la expresión génica y la cuantificación del ARN viral en entornos clínicos y de investigación.

La estrecha asociación entre RT-PCR y qPCR ha llevado al uso metonímico del término qPCR para significar RT-PCR. Este uso puede ser confuso, [2] ya que RT-PCR se puede utilizar sin qPCR, por ejemplo, para permitir la clonación molecular , la secuenciación o la simple detección de ARN. Por el contrario, qPCR se puede utilizar sin RT-PCR, por ejemplo, para cuantificar el número de copias de un fragmento específico de ADN.

Nomenclatura

La técnica combinada de RT-PCR y qPCR se ha descrito como RT-PCR cuantitativa [3] o RT-PCR en tiempo real [4] (a veces incluso llamada RT-PCR cuantitativa en tiempo real [5] ), y se ha abreviado de diversas formas: qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] y rRT-PCR. [9] Para evitar confusiones, las siguientes abreviaturas se utilizarán de forma coherente a lo largo de este artículo:

No todos los autores, especialmente los más antiguos, utilizan esta convención y el lector debe tener cuidado al seguir los enlaces. La RT-PCR se ha utilizado para indicar tanto la PCR en tiempo real (qPCR) como la PCR con transcripción inversa (RT-PCR).

Historia

Desde su introducción en 1977, el Northern blot se ha utilizado ampliamente para la cuantificación de ARN a pesar de sus deficiencias: (a) es una técnica que consume mucho tiempo, (b) requiere una gran cantidad de ARN para su detección y (c) es cuantitativamente inexacta debido a la baja abundancia de contenido de ARN. [10] [11] Sin embargo, desde que Kary Mullis inventó la PCR en 1983, la RT PCR ha desplazado al Northern blot como el método de elección para la detección y cuantificación de ARN. [12]

La RT-PCR se ha convertido en la tecnología de referencia para la detección y/o comparación de los niveles de ARN por varias razones: (a) no requiere procesamiento posterior a la PCR, (b) se puede medir un amplio rango (>10 7 -veces) de abundancia de ARN, y (c) proporciona información sobre datos tanto cualitativos como cuantitativos. [5] Debido a su simplicidad, especificidad y sensibilidad, la RT-PCR se utiliza en una amplia gama de aplicaciones , desde experimentos tan simples como la cuantificación de células de levadura en vino hasta usos más complejos como herramientas de diagnóstico para detectar agentes infecciosos como el virus de la gripe aviar y el SARS-CoV-2 . [13] [14] [15]

Principios

En la RT-PCR, el ARN molde se convierte primero en ADN complementario (ADNc) mediante una transcriptasa inversa (RT). A continuación, el ADNc se utiliza como molde para la amplificación exponencial mediante PCR. El uso de la RT-PCR para la detección de la transcripción del ARN ha revolucionado el estudio de la expresión génica de las siguientes maneras importantes:

RT-PCR de un solo paso frente a RT-PCR de dos pasos

RT-PCR de un paso frente a RT-PCR de dos pasos

La cuantificación de ARNm mediante RT-PCR se puede lograr como una reacción de un solo paso o de dos pasos. La diferencia entre los dos enfoques radica en el número de tubos utilizados al realizar el procedimiento. La reacción de dos pasos requiere que la reacción de transcriptasa inversa y la amplificación por PCR se realicen en tubos separados. La desventaja del enfoque de dos pasos es la susceptibilidad a la contaminación debido a la manipulación más frecuente de las muestras. [19] Por otro lado, toda la reacción desde la síntesis de ADNc hasta la amplificación por PCR ocurre en un solo tubo en el enfoque de un solo paso. Se cree que el enfoque de un solo paso minimiza la variación experimental al contener todas las reacciones enzimáticas en un solo entorno. Elimina los pasos de pipetear el producto de ADNc, que requiere mucha mano de obra y es propenso a la contaminación, a la reacción de PCR. El uso adicional de ADN polimerasas termoestables tolerantes a inhibidores , potenciadores de polimerasa con una condición optimizada de RT-PCR de un solo paso, respalda la transcripción inversa del ARN de muestras no purificadas o crudas, como sangre completa y suero . [20] [21] Sin embargo, las plantillas de ARN de partida son propensas a la degradación en el enfoque de un solo paso, y el uso de este enfoque no se recomienda cuando se requieren ensayos repetidos de la misma muestra. Además, se informa que el enfoque de un solo paso es menos preciso en comparación con el enfoque de dos pasos. También es el método de análisis preferido cuando se utilizan colorantes de unión al ADN como SYBR Green, ya que la eliminación de dímeros de cebadores se puede lograr a través de un simple cambio en la temperatura de fusión . Sin embargo, el enfoque de un solo paso es una solución relativamente conveniente para la detección rápida del ARN objetivo directamente en la biodetección. [ cita requerida ]

RT-PCR de punto final frente a RT-PCR en tiempo real

La cuantificación de los productos de RT-PCR se puede dividir en dos categorías: punto final y tiempo real. [22] El uso de RT-PCR de punto final se prefiere para medir los cambios en la expresión genética en un pequeño número de muestras, pero la RT-PCR en tiempo real se ha convertido en el método estándar de oro para validar los resultados cuantitativos obtenidos a partir de análisis de matrices o cambios en la expresión genética a escala global. [23]

RT-PCR de punto final

Los métodos de medición de la RT-PCR de punto final requieren la detección de los niveles de expresión génica mediante el uso de colorantes fluorescentes como el bromuro de etidio , [24] [25] el etiquetado P32 de los productos de PCR utilizando un phosphorimager , [26] o mediante recuento de centelleo . [18] La RT-PCR de punto final se logra comúnmente utilizando tres métodos diferentes: relativo, competitivo y comparativo. [27] [28]

RT-PCR relativa
Las cuantificaciones relativas de la RT-PCR implican la coamplificación de un control interno simultáneamente con el gen de interés. El control interno se utiliza para normalizar las muestras. Una vez normalizadas, se puede realizar una comparación directa de las abundancias relativas de transcripción en múltiples muestras de ARNm. Una precaución a tener en cuenta es que el control interno debe elegirse de manera que no se vea afectado por el tratamiento experimental. El nivel de expresión debe ser constante en todas las muestras y con el ARNm de interés para que los resultados sean precisos y significativos. Debido a que la cuantificación de los resultados se analiza comparando el rango lineal de la amplificación del objetivo y del control, es crucial tener en cuenta la concentración inicial de las moléculas objetivo y su tasa de amplificación antes de comenzar el análisis. Los resultados del análisis se expresan como las proporciones de la señal del gen a la señal del control interno, cuyos valores pueden usarse luego para la comparación entre las muestras en la estimación de la expresión relativa del ARN objetivo. [25] [28] [29]
RT-PCR competitiva
La técnica de RT-PCR competitiva se utiliza para la cuantificación absoluta. Implica el uso de un ARN “competidor” sintético que se puede distinguir del ARN diana por una pequeña diferencia en tamaño o secuencia. Es importante que el diseño del ARN sintético sea idéntico en secuencia pero ligeramente más corto que el ARN diana para obtener resultados precisos. Una vez diseñado y sintetizado, se añade una cantidad conocida del ARN competidor a las muestras experimentales y se coamplifica con el ARN diana mediante RT-PCR. Luego, se produce una curva de concentración del ARN competidor y se utiliza para comparar las señales de RT-PCR producidas a partir de las transcripciones endógenas para determinar la cantidad de ARN diana presente en la muestra. [28] [30]
RT-PCR comparativa
La RT-PCR comparativa es similar a la RT-PCR competitiva en que el ARN diana compite por reactivos de amplificación dentro de una única reacción con un estándar interno de secuencia no relacionada. Una vez que se completa la reacción, los resultados se comparan con una curva estándar externa para determinar la concentración de ARN diana. En comparación con los métodos de cuantificación relativa y competitiva, se considera que la RT-PCR comparativa es el método más conveniente de usar, ya que no requiere que el investigador realice un experimento piloto; en la RT-PCR relativa, el rango de amplificación exponencial del ARNm debe estar predeterminado y en la RT-PCR competitiva, se debe sintetizar un ARN competidor sintético. [28] [31] [32] [33] [34]

RT-PCR en tiempo real

La aparición de nuevas técnicas de etiquetado de ADN fluorescente en los últimos años ha permitido el análisis y la detección de productos de PCR en tiempo real y, en consecuencia, ha llevado a la adopción generalizada de RT-PCR en tiempo real para el análisis de la expresión genética. [35] La RT-PCR en tiempo real no solo es ahora el método de elección para la cuantificación de la expresión genética, sino que también es el método preferido para obtener resultados de análisis de matrices y expresiones genéticas a escala mundial. [36] Actualmente, hay cuatro sondas de ADN fluorescentes diferentes disponibles para la detección de productos de PCR mediante RT-PCR en tiempo real: SYBR Green , TaqMan , balizas moleculares y sondas de escorpión. Todas estas sondas permiten la detección de productos de PCR generando una señal fluorescente. Mientras que el colorante SYBR Green emite su señal fluorescente simplemente al unirse al ADN bicatenario en solución, la generación de fluorescencia de las sondas TaqMan, las balizas moleculares y los escorpiones depende del acoplamiento por transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) de la molécula del colorante y una fracción extintora a los sustratos de oligonucleótidos. [37]

SYBR Verde
Cuando el SYBR Green se une al ADN bicatenario de los productos de PCR, emitirá luz al excitarse. La intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que se acumulan los productos de PCR. Esta técnica es fácil de usar, ya que no es necesario diseñar sondas debido a la falta de especificidad de su unión. Sin embargo, dado que el colorante no discrimina el ADN bicatenario de los productos de PCR y los de los dímeros de cebadores, la sobreestimación de la concentración objetivo es un problema común. Cuando la cuantificación precisa es una necesidad absoluta, se deben realizar ensayos adicionales para la validación de los resultados. Sin embargo, entre los métodos de detección de productos de RT-PCR en tiempo real, SYBR Green es el más económico y fácil de usar. [22] [23]
Sondas Taqman
Sondas TaqMan
Las sondas TaqMan son oligonucleótidos que tienen una sonda fluorescente unida al extremo 5' y un inhibidor de fluorescencia al extremo 3'. Durante la amplificación por PCR, estas sondas se hibridarán con las secuencias diana ubicadas en el amplicón y, a medida que la polimerasa replica la plantilla con TaqMan unido, también escinde la sonda fluorescente debido a la actividad de la nucleasa 5' de la polimerasa. Debido a que la proximidad cercana entre la molécula inhibidora de fluorescencia y la sonda fluorescente normalmente impide que se detecte la fluorescencia a través de FRET, el desacoplamiento da como resultado un aumento de la intensidad de la fluorescencia proporcional al número de ciclos de escisión de la sonda. Aunque las sondas TaqMan bien diseñadas producen resultados precisos de RT-PCR en tiempo real, es costoso y requiere mucho tiempo sintetizarlas cuando se deben hacer sondas separadas para cada diana de ARNm analizada. [22] [16] [38] Además, estas sondas son sensibles a la luz y deben congelarse cuidadosamente como alícuotas para evitar la degradación.
Sondas de baliza molecular
De manera similar a las sondas TaqMan, las balizas moleculares también hacen uso de la detección FRET con sondas fluorescentes unidas al extremo 5' y un extintor unido al extremo 3' de un sustrato de oligonucleótido. Sin embargo, mientras que las sondas fluorescentes TaqMan se escinden durante la amplificación, las sondas de baliza molecular permanecen intactas y se vuelven a unir a un nuevo objetivo durante cada ciclo de reacción. Cuando están libres en solución, la proximidad de la sonda fluorescente y la molécula extintora evita la fluorescencia a través de FRET. Sin embargo, cuando las sondas de baliza molecular se hibridan con un objetivo, el colorante fluorescente y el extintor se separan, lo que da como resultado la emisión de luz tras la excitación. Al igual que con las sondas TaqMan, las balizas moleculares son caras de sintetizar y requieren sondas separadas para cada objetivo de ARN. [19]
Sondas de escorpión
Las sondas Scorpion, al igual que las balizas moleculares, no serán activas en fluorescencia en un estado no hibridado, nuevamente, debido a que la sonda fluorescente en el extremo 5' es extinguida por la fracción en el extremo 3' de un oligonucleótido. Sin embargo, con Scorpions, el extremo 3' también contiene una secuencia que es complementaria al producto de extensión del cebador en el extremo 5'. Cuando la extensión Scorpion se une a su complemento en el amplicón, la estructura Scorpion se abre, evita la FRET y permite que se mida la señal fluorescente. [39]
Sondas multiplex
Las sondas TaqMan, las balizas moleculares y los escorpiones permiten la medición simultánea de productos de PCR en un solo tubo. Esto es posible porque cada uno de los diferentes colorantes fluorescentes se puede asociar a un espectro de emisión específico. El uso de sondas multiplex no solo ahorra tiempo y esfuerzo sin comprometer la utilidad de la prueba, sino que su aplicación en amplias áreas de investigación, como el análisis de deleción de genes, el análisis de mutaciones y polimorfismos, el análisis cuantitativo y la detección de ARN, lo convierten en una técnica invaluable para laboratorios de muchas disciplinas. [39] [40] [41]

Se emplean comúnmente dos estrategias para cuantificar los resultados obtenidos mediante RT-PCR en tiempo real: el método de la curva estándar y el método del umbral comparativo. [42]

Solicitud

La amplificación exponencial mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa proporciona una técnica de alta sensibilidad en la que se puede detectar un número muy bajo de copias de moléculas de ARN. La RT-PCR se utiliza ampliamente en el diagnóstico de enfermedades genéticas y, de forma semicuantitativa, en la determinación de la abundancia de diferentes moléculas de ARN específicas dentro de una célula o tejido como medida de la expresión génica .

Métodos de investigación

La RT-PCR se utiliza habitualmente en métodos de investigación para medir la expresión génica. Por ejemplo, Lin et al. utilizaron qRT-PCR para medir la expresión de genes Gal en células de levadura. En primer lugar, Lin et al. diseñaron una mutación de una proteína sospechosa de participar en la regulación de los genes Gal. Se planteó la hipótesis de que esta mutación abolía selectivamente la expresión de Gal. Para confirmarlo, se analizaron los niveles de expresión génica de las células de levadura que contenían esta mutación mediante qRT-PCR. Los investigadores pudieron determinar de manera concluyente que la mutación de esta proteína reguladora reducía la expresión de Gal. [43] El análisis Northern blot se utiliza para estudiar más a fondo la expresión génica del ARN.

Inserción de genes

La RT-PCR también puede ser muy útil en la inserción de genes eucariotas en procariotas . Debido a que la mayoría de los genes eucariotas contienen intrones , que están presentes en el genoma pero no en el ARNm maduro, el ADNc generado a partir de una reacción de RT-PCR es la secuencia de ADN exacta (sin tener en cuenta la naturaleza propensa a errores de las transcriptasas inversas) que se traduciría directamente en proteína después de la transcripción . Cuando estos genes se expresan en células procariotas con el fin de producir o purificar proteínas, el ARN producido directamente a partir de la transcripción no necesita sufrir empalme, ya que la transcripción contiene solo exones . (Los procariotas, como E. coli, carecen del mecanismo de empalme del ARNm de los eucariotas).

Diagnóstico de enfermedades genéticas

La RT-PCR se puede utilizar para diagnosticar enfermedades genéticas como el síndrome de Lesch-Nyhan . Esta enfermedad genética es causada por un mal funcionamiento del gen HPRT1 , que clínicamente conduce a cálculos urinarios de ácido úrico fatales y síntomas similares a la gota . [6] [ Aclaración necesaria ] El análisis de una madre embarazada y un feto para determinar los niveles de expresión de ARNm de HPRT1 revelará si la madre es portadora y si el feto es propenso a desarrollar el síndrome de Lesch-Nyhan. [44]

Detección de cáncer

Los científicos están trabajando en formas de utilizar la RT-PCR en la detección del cáncer para ayudar a mejorar el pronóstico y monitorear la respuesta a la terapia. Las células tumorales circulantes producen transcripciones de ARNm únicas según el tipo de cáncer. El objetivo es determinar qué transcripciones de ARNm sirven como los mejores biomarcadores para un tipo particular de célula cancerosa y luego analizar sus niveles de expresión con RT-PCR. [45]

La RT-PCR se utiliza comúnmente para estudiar los genomas de virus cuyos genomas están compuestos de ARN, como el virus de la influenza A , retrovirus como el VIH y el SARS-CoV-2 . [46]

Desafíos

A pesar de sus principales ventajas, la RT-PCR no está exenta de inconvenientes. El crecimiento exponencial del ADN complementario transcrito de forma inversa (ADNc) durante los múltiples ciclos de PCR produce una cuantificación inexacta del punto final debido a la dificultad de mantener la linealidad. [47] Para proporcionar una detección y cuantificación precisas del contenido de ARN en una muestra, se desarrolló la qRT-PCR utilizando una modificación basada en fluorescencia para monitorear los productos de amplificación durante cada ciclo de PCR. La extrema sensibilidad de la técnica puede ser un arma de doble filo, ya que incluso la más mínima contaminación del ADN puede conducir a resultados indeseables. [48] Un método simple para la eliminación de resultados falsos positivos es incluir anclajes, o etiquetas , en la región 5' de un cebador específico del gen. [49] Además, la planificación y el diseño de estudios de cuantificación pueden ser técnicamente desafiantes debido a la existencia de numerosas fuentes de variación, incluida la concentración de la plantilla y la eficiencia de la amplificación. [31] La adición de una cantidad conocida de ARN a una muestra, la adición de una serie de diluciones de ARN que generan una curva estándar y la adición de una muestra sin copia de plantilla (sin ADNc) pueden usarse como controles.

Protocolo

La RT-PCR se puede realizar mediante el protocolo RT-PCR de un solo paso o mediante el protocolo RT-PCR de dos pasos.

RT-PCR de un solo paso

La RT-PCR de un solo paso somete a dianas de ARNm (de hasta 6 kb) a transcripción inversa seguida de amplificación por PCR en un solo tubo de ensayo. El uso de ARN intacto de alta calidad y un cebador específico de secuencia producirá los mejores resultados.

Una vez que se selecciona un kit de RT-PCR de un solo paso con una mezcla de transcriptasa inversa, polimerasa de ADN Taq y una polimerasa correctora y se obtienen todos los materiales y equipos necesarios, se debe preparar una mezcla de reacción. La mezcla de reacción incluye dNTP, cebadores, ARN molde, enzimas necesarias y una solución tampón. La mezcla de reacción se agrega a un tubo de PCR para cada reacción, seguido del ARN molde. Luego, los tubos de PCR se colocan en un ciclador térmico para comenzar el ciclo. En el primer ciclo, se produce la síntesis de ADNc. El segundo ciclo es la desnaturalización inicial en la que se inactiva la transcriptasa inversa. Los 40-50 ciclos restantes son la amplificación, que incluye desnaturalización, hibridación y elongación. Cuando se completa la amplificación, los productos de RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel . [50] [51]

(Manual de aplicaciones de PCR y Biotools)

RT-PCR de dos pasos

La RT-PCR de dos pasos, como su nombre lo indica, se realiza en dos pasos. Primero la transcripción inversa y luego la PCR. Este método es más sensible que el método de un solo paso. Los kits también son útiles para la RT-PCR de dos pasos. Al igual que para la PCR de un solo paso, utilice solo ARN intacto de alta calidad para obtener los mejores resultados. El cebador para la PCR de dos pasos no tiene que ser específico de la secuencia.

Paso uno

Primero, combine el ARN molde, el cebador, la mezcla de dNTP y el agua sin nucleasas en un tubo de PCR. Luego, agregue un inhibidor de ARNasa y transcriptasa inversa al tubo de PCR. A continuación, coloque el tubo de PCR en un termociclador durante un ciclo en el que se produce la hibridación, la extensión y la inactivación de la transcriptasa inversa. Por último, proceda directamente al paso dos, que es la PCR, o almacene el producto en hielo hasta que se pueda realizar la PCR.

Paso dos

Agregue la mezcla maestra que contiene el tampón, la mezcla de dNTP, MgCl2 , la polimerasa Taq y agua libre de nucleasas a cada tubo de PCR. Luego agregue el cebador necesario a los tubos. A continuación, coloque los tubos de PCR en un termociclador durante 30 ciclos del programa de amplificación. Esto incluye desnaturalización, hibridación y elongación. Los productos de la RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel. [52]

Pautas de publicación

El ensayo de RT-PCR cuantitativa se considera el estándar de oro para medir el número de copias de dianas de ADNc específicas en una muestra, pero está poco estandarizado. [53] Como resultado, si bien existen numerosas publicaciones que utilizan la técnica, muchas proporcionan detalles experimentales inadecuados y utilizan análisis de datos inadecuados para extraer conclusiones inapropiadas. Debido a la variabilidad inherente en la calidad de cualquier dato de PCR cuantitativa, no solo los revisores tienen dificultades para evaluar estos manuscritos, sino que los estudios también se vuelven imposibles de replicar. [54] Reconociendo la necesidad de la estandarización de la notificación de las condiciones experimentales, un consorcio internacional de científicos académicos ha publicado las directrices de Información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real (MIQE, pronunciado mykee). Las directrices MIQE describen la información mínima necesaria para evaluar experimentos de PCR cuantitativa que se debe exigir para la publicación con el fin de fomentar una mejor práctica experimental y garantizar la relevancia, precisión, interpretación correcta y repetibilidad de los datos de PCR cuantitativa. [55]

Además de las directrices de presentación de informes, el MIQE destaca la necesidad de estandarizar la nomenclatura asociada con la PCR cuantitativa para evitar confusiones; por ejemplo, la abreviatura qPCR debería utilizarse para la PCR cuantitativa en tiempo real , mientras que RT-qPCR debería utilizarse para la transcripción inversa-qPCR, y los genes utilizados para la normalización deberían denominarse genes de referencia en lugar de genes de mantenimiento . También propone que no se utilicen términos derivados comercialmente como sondas TaqMan , sino que se los denomine sondas de hidrólisis . Además, se propone que se utilice el ciclo de cuantificación (Cq) para describir el ciclo de PCR utilizado para la cuantificación en lugar del ciclo umbral (Ct), el punto de cruce (Cp) y el punto de despegue (TOP), que se refieren al mismo valor pero fueron acuñados por diferentes fabricantes de instrumentos en tiempo real . [53]

La guía consta de los siguientes elementos: 1) diseño experimental, 2) muestra, 3) extracción de ácidos nucleicos, 4) transcripción inversa, 5) información del objetivo de la qPCR, 6) oligonucleótidos, 7) protocolo, 8) validación y 9) análisis de datos. Los elementos específicos dentro de cada elemento llevan una etiqueta de E (esencial) o D (deseable). Los etiquetados como E se consideran críticos e indispensables, mientras que los etiquetados como D se consideran periféricos pero importantes para las mejores prácticas. [55]

Referencias

  1. ^ Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE (enero de 1999). "RT-PCR cuantitativa: trampas y potencial". BioTechniques . 26 (1): 112–22, 124–5. doi : 10.2144/99261rv01 . PMID  9894600.
  2. ^ Mackay, Ian (2007). PCR en tiempo real en microbiología: del diagnóstico a la caracterización . Norfolk, Inglaterra: Caister Academic Press. pp. 440. ISBN. 978-1-904455-18-9.
  3. ^ Joyce C (2002). "RT-PCR cuantitativa: una revisión de las metodologías actuales". Protocolos de RT-PCR . Métodos Mol. Biol. Vol. 193. págs. 83–92. doi :10.1385/1-59259-283-X:083. ISBN 978-1-59259-283-8. Número de identificación personal  12325527.
  4. ^ Kang XP, Jiang T, Li YQ, et al. (2010). "Un ensayo de RT-PCR dúplex en tiempo real para detectar el virus de la influenza aviar H5N1 y el virus de la influenza pandémica H1N1". Virol. J. 7 : 113. doi : 10.1186/1743-422X-7-113 . PMC 2892456. PMID  20515509 . 
  5. ^ ab Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (junio de 2005). "RT-PCR cuantitativa en tiempo real: una perspectiva". J. Mol. Endocrinol . 34 (3): 597–601. CiteSeerX 10.1.1.528.6638 . doi :10.1677/jme.1.01755. PMID  15956331. S2CID  1754364. 
  6. ^ Varkonyi-Gasic E, Hellens RP (2010). "qRT-PCR de ARN pequeños". Epigenética vegetal . Métodos en biología molecular. Vol. 631. págs. 109-22. doi :10.1007/978-1-60761-646-7_10. ISBN 978-1-60761-645-0. Número de identificación personal  20204872.
  7. ^ Taylor S, Wakem M, Dijkman G, Alsarraj M, Nguyen M (abril de 2010). "Un enfoque práctico para la publicación de datos de RT-qPCR que se ajusten a las directrices de MIQE". Métodos . 50 (4): S1–5. doi :10.1016/j.ymeth.2010.01.005. PMID  20215014.
  8. ^ Spackman E, Senne DA, Myers TJ, et al. (septiembre de 2002). "Desarrollo de un ensayo de PCR con transcriptasa inversa en tiempo real para el virus de la influenza tipo A y los subtipos de hemaglutinina aviar H5 y H7". J. Clin. Microbiol . 40 (9): 3256–60. doi :10.1128/jcm.40.9.3256-3260.2002. PMC 130722 . PMID  12202562. 
  9. ^ "RESUMEN DE LA AUTORIZACIÓN DE USO DE EMERGENCIA ACELERADA (EUA) PRUEBA RT-PCR COVID-19 (LABORATORY CORPORATION OF AMERICA)". FDA . Consultado el 3 de abril de 2020 .
  10. ^ Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (diciembre de 1977). "Método para la detección de ARN específicos en geles de agarosa mediante transferencia a papel diazobenciloximetilo e hibridación con sondas de ADN". Proc. Natl. Sci. EE. UU . . 74 (12): 5350–4. Bibcode :1977PNAS...74.5350A. doi : 10.1073/pnas.74.12.5350 . PMC 431715 . PMID  414220. 
  11. ^ Streit S, Michalski CW, Erkan M, Kleeff J, Friess H (2009). "Análisis de transferencia Northern para la detección y cuantificación de ARN en células y tejidos de cáncer de páncreas". Nat Protoc . 4 (1): 37–43. doi :10.1038/nprot.2008.216. PMID  19131955. S2CID  24980302.
  12. ^ Bustin SA (octubre de 2000). "Cuantificación absoluta de ARNm mediante ensayos de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real". J. Mol. Endocrinol . 25 (2): 169–93. doi : 10.1677/jme.0.0250169 . PMID  11013345.
  13. ^ Hierro N, Esteve-Zarzoso B, González A, Mas A, Guillamón JM (noviembre de 2006). "PCR cuantitativa en tiempo real (QPCR) y QPCR de transcripción inversa para la detección y enumeración de levaduras totales en vino". Appl. Environ. Microbiol . 72 (11): 7148–55. Bibcode :2006ApEnM..72.7148H. doi :10.1128/AEM.00388-06. PMC 1636171 . PMID  17088381. 
  14. ^ Slomka MJ, Pavlidis T, Coward VJ, et al. (julio de 2009). "Métodos validados de PCR con transcriptasa inversa en tiempo real para el diagnóstico y la patotipificación de los virus de la influenza aviar H7 de Eurasia". Influenza and Other Respiratory Viruses . 3 (4): 151–64. doi :10.1111/j.1750-2659.2009.00083.x. PMC 4634683 . PMID  19627372. 
  15. ^ Resumen de la misión: Visita de campo de la OMS a Wuhan (China), 20 y 21 de enero de 2020: https://www.who.int/china/news/detail/22-01-2020-field-visit-wuhan-china-jan-2020
  16. ^ ab Deepak S, Kottapalli K, Rakwal R, et al. (junio de 2007). "PCR en tiempo real: revolucionando la detección y el análisis de expresión de genes". Curr. Genomics . 8 (4): 234–51. doi :10.2174/138920207781386960. PMC 2430684 . PMID  18645596. 
  17. ^ ab Bustin SA (agosto de 2002). "Cuantificación de ARNm mediante PCR de transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR): tendencias y problemas". J. Mol. Endocrinol . 29 (1): 23–39. doi : 10.1677/jme.0.0290023 . PMID  12200227.
  18. ^ ab Souazé F, Ntodou-Thomé A, Tran CY, Rostène W, Forgez P (agosto de 1996). "RT-PCR cuantitativa: límites y precisión". BioTechniques . 21 (2): 280–5. doi : 10.2144/96212rr01 . PMID  8862813.
  19. ^ ab Wong ML, Medrano JF (julio de 2005). "PCR en tiempo real para cuantificación de ARNm". BioTechniques . 39 (1): 75–85. doi : 10.2144/05391rv01 . PMID  16060372.
  20. ^ Li, Lang; He, Jian-an; Wang, Wei; Xia, Yun; Song, Li; Chen, Ze-han; Zuo, Hang-zhi; Tan, Xuan-Ping; Ho, Aaron Ho-Pui; Kong, Siu-Kai; Loo, Jacky Fong-Chuen (1 de agosto de 2019). "Desarrollo de un ensayo de PCR cuantitativa con transcripción inversa directa (dirRT-qPCR) para el diagnóstico clínico del Zika". Revista Internacional de Enfermedades Infecciosas . 85 : 167–174. doi : 10.1016/j.ijid.2019.06.007 . ISSN  1201-9712. PMID  31202908.
  21. ^ Bachofen, Claudia; Willoughby, Kim; Zadoks, Ruth; Burr, Paul; Mellor, Dominic; Russell, George C. (1 de junio de 2013). "La RT-PCR directa a partir del suero permite un análisis filogenético rápido y rentable del virus de la diarrea viral bovina". Journal of Virological Methods . 190 (1): 1–3. doi :10.1016/j.jviromet.2013.03.015. ISSN  0166-0934. PMID  23541784.
  22. ^ abc Schmittgen TD, Zakrajsek BA, Mills AG, Gorn V, Singer MJ, Reed MW (octubre de 2000). "Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa para estudiar la degradación del ARNm: comparación de los métodos de punto final y en tiempo real". Anal. Biochem . 285 (2): 194–204. doi :10.1006/abio.2000.4753. PMID  11017702. S2CID  258810.
  23. ^ ab Rajeevan MS, Vernon SD, Taysavang N, Unger ER (febrero de 2001). "Validación de perfiles de expresión génica basados ​​en matrices mediante RT-PCR (cinética) en tiempo real". J Mol Diagn . 3 (1): 26–31. doi :10.1016/S1525-1578(10)60646-0. PMC 1907344 . PMID  11227069. 
  24. ^ Stone-Marschat M, Carville A, Skowronek A, Laegreid WW (marzo de 1994). "Detección del virus de la peste equina africana mediante PCR con transcripción inversa". J. Clin. Microbiol . 32 (3): 697–700. doi :10.1128/JCM.32.3.697-700.1994. PMC 263109 . PMID  8195381. 
  25. ^ ab Minton AP (abril de 1995). "El confinamiento como determinante de la estructura y reactividad macromolecular. II. Efectos de interacciones débilmente atractivas entre macrosolutos confinados y estructuras confinantes". Biophys. J . 68 (4): 1311–22. Bibcode :1995BpJ....68.1311M. doi :10.1016/S0006-3495(95)80304-8. PMC 1282026 . PMID  7787020. 
  26. ^ Hsu M, Yu EY, Sprušanský O, McEachern MJ, Lue NF (julio de 2012). "El análisis funcional del homólogo único Est1/Ebs1 en Kluyveromyces lactis revela funciones tanto en el mantenimiento de los telómeros como en la resistencia a la rapamicina". Eukaryotic Cell . 11 (7): 932–42. doi :10.1128/EC.05319-11. PMC 3416500 . PMID  22544908. 
  27. ^ Schmittgen TD, Livak KJ (2008). "Análisis de datos de PCR en tiempo real mediante el método comparativo C(T)". Nat Protoc . 3 (6): 1101–8. doi :10.1038/nprot.2008.73. PMID  18546601. S2CID  205464270.
  28. ^ abcd Tang, Yi-Wei (13 de septiembre de 2012), Técnicas avanzadas en microbiología diagnóstica , Springer, ISBN 978-1461439691
  29. ^ Gause WC, Adamovicz J (junio de 1994). "El uso de la PCR para cuantificar la expresión génica". Genome Research . 3 (6): S123–35. doi : 10.1101/gr.3.6.s123 . PMID  7522722.
  30. ^ Tsai SJ, Wiltbank MC (noviembre de 1996). "Cuantificación de ARNm mediante RT-PCR competitiva con metodología de curva estándar". BioTechniques . 21 (5): 862–6. doi : 10.2144/96215st04 . PMID  8922627.
  31. ^ ab Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF (marzo de 2003). "Análisis sin suposiciones de datos cuantitativos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real". Neurosci. Lett . 339 (1): 62–6. doi :10.1016/S0304-3940(02)01423-4. PMID  12618301. S2CID  9459695.
  32. ^ Halford WP, ​​Falco VC, Gebhardt BM, Carr DJ (enero de 1999). "La capacidad cuantitativa inherente de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa". Anal. Biochem . 266 (2): 181–91. doi : 10.1006/abio.1998.2913 . PMID  9888974.
  33. ^ King N (2010). "El uso de RT-PCR cuantitativa comparativa para investigar el efecto de la incubación con cisteína en la expresión de GPx1 en cardiomiocitos recién aislados". Protocolos de RT-PCR . Métodos en biología molecular. Vol. 630. págs. 215–32. doi :10.1007/978-1-60761-629-0_14. ISBN 978-1-60761-628-3. Número de identificación personal  20301000.
  34. ^ Chang JT, Chen IH, Liao CT, et al. (noviembre de 2002). "Un método de PCR en tiempo real comparativo de transcripción inversa para la detección cuantitativa de factores de crecimiento angiogénicos en pacientes con cáncer de cabeza y cuello". Clin. Biochem . 35 (8): 591–6. doi :10.1016/S0009-9120(02)00403-4. PMID  12498992.
  35. ^ Lu, Rou-Jian; Zhao, Li; Huang, Bao-Ying; Ye, Fei; Wang, Wen-Ling; Tan, Wen-Jie (5 de septiembre de 2021). "Panel de ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real para la detección del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo y sus variantes". Revista Médica China . 134 (17): 2048–2053. doi :10.1097/CM9.0000000000001687. PMC 8439998 . PMID  34402479 . Consultado el 17 de febrero de 2023 . 
  36. ^ Jawerth, Nicole (27 de marzo de 2020). «¿Cómo se detecta el virus COVID-19 mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real?». Organismo Internacional de Energía Atómica . Consultado el 16 de febrero de 2023 .
  37. ^ Holden, MJ; Wang, L. (2008). "PCR cuantitativa en tiempo real: opciones y problemas de la sonda fluorescente". Estandarización y garantía de calidad en mediciones de fluorescencia II . Springer Series on Fluorescence. Vol. 6. p. 489. doi :10.1007/4243_2008_046. ISBN 978-3-540-70570-3.
  38. ^ Yang DK, Kweon CH, Kim BH, et al. (diciembre de 2004). "Reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa TaqMan para la detección del virus de la encefalitis japonesa". J. Vet. Sci . 5 (4): 345–51. doi : 10.4142/jvs.2004.5.4.345 . PMID  15613819.
  39. ^ ab Sharkey FH, Banat IM, Marchant R (julio de 2004). "Detección y cuantificación de la expresión génica en bacteriología medioambiental". Appl. Environ. Microbiol . 70 (7): 3795–806. Bibcode :2004ApEnM..70.3795S. doi : 10.1128/AEM.70.7.3795-3806.2004. PMC 444812. PMID  15240248. 
  40. ^ Ratcliff RM, Chang G, Kok T, Sloots TP (julio de 2007). "Diagnóstico molecular de virus médicos". Curr Issues Mol Biol . 9 (2): 87–102. PMID  17489437.
  41. ^ Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE (octubre de 2000). "PCR multiplex: optimización y aplicación en virología diagnóstica". Clin. Microbiol. Rev. 13 ( 4): 559–70. doi : 10.1128/cmr.13.4.559-570.2000. PMC 88949. PMID  11023957. 
  42. ^ Bustin SA (julio de 2005). "PCR cuantitativa basada en fluorescencia en tiempo real: una instantánea de los procedimientos y preferencias actuales". Expert Rev. Mol. Diagn . 5 (4): 493–8. doi :10.1586/14737159.5.4.493. PMID  16013967. S2CID  1833811.
  43. ^ Lin L, Chamberlain L, Zhu LJ, Green MR (febrero de 2012). "Análisis de la activación de la transcripción dirigida por Gal4 utilizando mutantes Tra1 selectivamente defectuosos para la interacción con Gal4". Proc. Natl. Sci. USA . 109 (6): 1997–2002. Bibcode :2012PNAS..109.1997L. doi : 10.1073/pnas.1116340109 . PMC 3277556 . PMID  22308403. 
  44. ^ Torres RJ, Garcia MG, Puig JG (diciembre 2012). "Portador y diagnóstico prenatal de la enfermedad de Lesch-Nyhan debido a un defecto en la regulación de la expresión del gen HPRT". Gene . 511 (2): 306–7. doi :10.1016/j.gene.2012.09.121. PMID  23046577.
  45. ^ Xi L, Nicastri DG, El-Hefnawy T, Hughes SJ, Luketich JD, Godfrey TE (julio de 2007). "Marcadores óptimos para la detección cuantitativa en tiempo real mediante PCR de transcripción inversa de células tumorales circulantes de melanoma, cáncer de mama, colon, esófago, cabeza y cuello, y cáncer de pulmón". Clin. Chem . 53 (7): 1206–15. doi : 10.1373/clinchem.2006.081828 . PMID  17525108.
  46. ^ "Coronavirus: la prueba del viaje dei". Instituto Superior de Sanidad .
  47. ^ Shiao YH (diciembre de 2003). "Un nuevo método de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa para una cuantificación precisa". BMC Biotechnol . 3 : 22. doi : 10.1186/1472-6750-3-22 . PMC 317330 . PMID  14664723. 
  48. ^ Gettemy JM, Ma B, Alic M, Gold MH (febrero de 1998). "Análisis de PCR con transcripción inversa de la regulación de la familia de genes de la peroxidasa de manganeso". Appl. Environ. Microbiol . 64 (2): 569–74. Bibcode :1998ApEnM..64..569G. doi :10.1128/AEM.64.2.569-574.1998. PMC 106084 . PMID  9464395. 
  49. ^ Martel, Fatima; Dirk Grundemann; Edgar Schöig (31 de marzo de 2002). "Un método simple para la eliminación de resultados falsos positivos en RT-PCR". J Biochem Mol Biol . 35 (2): 248–250. doi : 10.5483/BMBRep.2002.35.2.248 . PMID  12297038.
  50. ^ "High Transcript Tools OneStep Kit". Biotools. Archivado desde el original el 20 de mayo de 2013. Consultado el 12 de diciembre de 2012 .
  51. ^ Degen, Hans-Joachim; Deufel, Annette; Eisel, Doris; Grünewald-Janho, Stefanie; Keesey, Joe (2006). Manual de aplicaciones de PCR (PDF) (3 ed.). Diagnóstico Roche. págs. 135-137.
  52. ^ "Protocolo RT-PCR de dos pasos" (PDF) . MIT . Consultado el 12 de diciembre de 2012 .
  53. ^ ab "www.microarrays.ca" (PDF) .
  54. ^ Bustin SA (abril de 2010). "¿Por qué es necesario contar con directrices para la publicación de qPCR? El caso de MIQE". Métodos . 50 (4): 217–26. doi :10.1016/j.ymeth.2009.12.006. PMID  20025972.
  55. ^ ab Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. (abril de 2009). "Las directrices de la MIQE: información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real". Clin. Chem . 55 (4): 611–22. doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID  19246619.

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